Поиск ингибиторов NHE-1 среди производных хиназолина in vitro

"Научный аспект №7-2024" - Медицина

УДК 615.2

Гаджимагомедова Аделина Гаджимагомедовна – студент медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.

Володичева-Байран Катарина Витальевна – студент лечебного факультета Волгоградского государственного медицинского университета.

Степанова Валентина Александровна – студент педиатрического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.

Научный руководитель Гурова Наталья Алексеевна – доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии и биоинформатики, доцент Волгоградского государственного медицинского университета.

Аннотация: Статья посвящена одному из перспективных подходов поисков ингибиторов NHE-1, в том числе среди производных хиназолина. Поиск, изучение и создание новых цитопротекторных средств является актуальной задачей в решении проблемы улучшения прогноза сердечно-сосудистых, онкологических и неврологических заболеваний.

Ключевые слова: NHE-1, Na⁺/H⁺-обменник, натрий-водородный обменник 1 изоформы, производные хиназолина, тромбоциты, исследования in vitro.

Введение

По данным всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) заболевания сердечно-сосудистой системы, сахарный диабет, неврологические и онкологические заболевания являются ведущими причинами смертности больше 20 лет, в силу чего уделяется большое внимание фармакологическому подходу к лечению данных патологий. Одним из перспективных подходов может стать поиск ингибиторов NHE-1, в том числе среди производных хиназолина. Поиск, изучение и создание новых цитопротекторных средств является актуальной задачей в решении проблемы улучшения прогноза сердечно-сосудистых, онкологических и неврологических заболеваний.

Натрий-водородный обменник 1 изоформы (NHE-1) – мембранный транспортер, участвующий в различных физиологических процессах играющий ключевую роль в регуляции внутриклеточного pH и уровней Na⁺ во многих типах клеток. По механизму воздействия в качестве антипортера и инициируя процесс, приводит к внутриклеточной перегрузке Ca²⁺ в кардиомиоцитах, регулирует клеточную адгезию, миграцию, пролиферацию и апоптоз [1, 2, 3,]. Из тринадцати известных в настоящее время изоформ NHE, NHE-1 является преобладающей изоформой, экспрессируемой во многих тканях и клетках.

Основные точки приложения ингибиторов NHE-1

• Сердечно-сосудистые заболевания: ишемия миокарда, аритмия, хроническая сердечная недостаточность (ХСН), аортокоронарное шунтирование
• Глаукома
• Цитокиновый шторм
• Заболевания ЦНС: ишемия головного мозга, эпилепсия, болезнь Альцгеймера и др.
• Онкологические заболевания
• СД 2 типа

Активация NHE-1 приводит к развитию «кальциевого парадокса» и играет важную роль в повреждении кардиомиоцитов миокарда и нейронов головного мозга. Использование ингибирующих веществ может существенно снизить тяжесть данной патологии. [1]. Были выявлены ингибиторы NHE среди производных хиназолина.

В настоящее время ведется активный поиск соединений с NHE-ингибирующей активностью. Международная база данных Thomson Reuters Integrity (2011) насчитывает 481 ингибитор NHE. Среди них находятся 262 производных гуанидина.

Согласно последним исследованиям, есть прямая связь между сердечными патологиями и сахарным диабетом. Большинство пациентов с сердечной недостаточностью страдают так же от сахарного диабета. [4] Активация изоформ NHE-1 в сердце и в почках натрий-водородного обменника могут иметь общий механизм, который объединяет обе патологий. Нечувствительность к инсулину и адипокиновые нарушения (признаки сахарного диабета 2 типа) являются характерными признаками сердечной недостаточности; и наоборот, нейрогормональные системы, активируемые при сердечной недостаточности (норадреналин, ангиотензин II, альдостерон и неприлизин), ухудшают чувствительность к инсулину и способствуют развитию микрососудистых заболеваний при сахарном диабете. Пациенты с сахарным диабетом проявляют нарушения в секреции и реакции на лептин, адипонектин, апелин и адипсин. Эти же сигнальные белки предположительно играют роль в защите β-клеток поджелудочной железы. Норадреналин, альдостерон и ангиотензин (эти показатели увеличиваются при сердечной недостаточности), а также глюкоза, инсулин и некоторые адипокины (которые увеличиваются при сахарном диабете 2 типа) стимулируют активность NHE-1 в сердце, кровеносных сосудах и в почках. (рис. 1) [5].

Рисунок 1. NHE-зависимые пути, предположительно связывающие патогенез сахарного диабета и сердечной недостаточности [5]

Биологический механизм, предположительно связывающий сахарный диабет и сердечную недостаточность, напрямую связан с работой натрий-водородного обменника (NHE). Существует больше 9 изоформ NHE, однако самый распространенный среди них NHE-1, который встречается повсеместно, но преобладающее большинство в сердце, где регулирует рН и защищает кардиомиоциты от ишемического повреждения. Повышенная активность NHE-1 может приводить к сосудистым повреждениям при сахарном диабете посредством инсулинорезистентности и эндотелиальной дисфункции на фоне гипергликемии. Высокая активность NHE-1 в почках при гипегликемии может усугубляться гломерулярной гиперфильтрацией, задержкой натрия и мезангиальной пролиферации. Также следует отметить, что согласно некоторым исследованиям по NHE-1, проводимым на клеточных линиях сетчатки крупного рогатого скота, была выявлена связь между повышенной экспрессией данной изоформы и развитием катаракты у пациентов с сахарным диабетом. [6].

NHE-1 были обнаружены и в нейронах симпатической нервной системы – пресинаптическая деятельность NHE-1 при ишемии определяет неэкзоцитозное высвобождение норэпинефрина в нервно-мышечном соединении. Устойчивая пресинаптическая стимуляция ангиотензин II-рецептора первого типа является одним из механизмов развития неишемической сердечной недостаточности, что увеличивает выброс норадреналина в нервно-мышечном соединении и ингибирует обратный захват норадреналина в нервных окончаниях с помощью механизма норэпинефринового переносчика, который ослабляется при помощи ингибирования NHE-1.

Теоретически, активация пресинаптических NHE-1 может быть важным шагом в развитии и прогрессировании ишемической или неишемической сердечной недостаточности. Создаются спусковые механизмы за счет увеличения выброса норэпинефрина и устойчивой стимуляции α- и β₁-адренорецепторов миокарда, повышается регуляция постсинаптической активности NHE-1 и связанные с ними неблагоприятные сердечные эффекты (рис. 2).

Рисунок 2. NHE в периферической нервной системе

Ишемия и реперфузия травмы являются сложными и не вполне понятными явлениями. «Ишемия лишает клетку энергии, необходимой для нормального функционирования, и приводит к нарушению ионного гомеостаза в клетке посредством воздействия на ионотропные рецепторы глутамата» и «глутамат-независимых каналов, чувствительными к рН, а также активации ион-транспортирующих белков, таких как NHE-1, Na⁺/K⁺/Cl^--котранспортера (NKCCl), а также Na⁺/Ca²⁺-обменник (NCXs)» [Hoyt, 1998]. Реперфузия запускает каскад (рис. 3) процессов в клетке, усугубляющие травмы. Высвобождение активных форм кислорода и медиаторов воспаление приводят к гибели клетки.

Рисунок 3. Роль NHE-1 в патофизиологии ишемического повреждения головного мозга.

Ишемия приводит к внутриклеточному ацидозу за счет перехода от аэробного к анаэробному гликолизу, и приводит к увеличению содержания Na⁺ и Ca²⁺ по механизму активации кислотно реагирующих ионных транспортеров. Последние данные подчеркивают важную роль NHE-1 в регуляции pH после церебральной ишемии и реперфузии.

Опухолевые клетки благодаря устойчивости к факторам, регулирующим деление, утрате способности к апоптозу и неограниченному пролиферативному потенциалу нуждаются в постоянном кровоснабжении. Вокруг новообразований характерно наличие внеклеточного ацидоза за счет повышенной выработки метаболических кислот. Для поддержания нормального гомеостаза клеток необходимо вытеснять лишние протоны водорода или нейтрализовать их через HCO3.

Натрий-водородного обменника изоформы 1 является распространенным мембранным транспортным белком, регулирующим рН в клетке, а усиление его экспрессии часто коррелирует со злокачественным новообразованием. Генетическое нарушение белков, регулирующих рН опухолевых клеток, снижают рост опухоли, об этом свидетельствуют некоторые исследования.

Нокаут белка натрий-водородного обменника изоформы 1 (NHE-1) из клеток MDA-MB-468, или тройного негативного рака молочной железы, приводил к снижению скорости миграции клеток (метастазирования), что доказывает его важную роль в развитии раковых клеток [7, 8] Согласно последним данным, воздействие сигаретного дыма на клетки пищевода Баррета увеличивает активность и экспрессию белка NHE-1. Причем увеличение активности было отмечено как в метапластических, так и в диспластических клетках. Предположительно, снижение пролиферации метапластических клеток связано со снижением жизнеспособности клеток при более высоких концентрациях сигаретного дыма. Таким образом, нарушение процессов регуляции рН приводит к нарушению вне- и внутриклеточного рН, что может привести к изменению клеточных функций, а также вызвать генетическую нестабильность.

Несмотря на десятилетия исследований, эффективное лечение и профилактика мозгового ишемического повреждения остается проблематичными. На данный момент успешно подавлена активность NHE-1 с помощью фармакологически активных молекул, что значительно уменьшило повреждение мозга после ишемического инсульта на моделях in vitro и in vivo.

Ингибиторы NHE-1 являются потенциальными целями для разработки кардио- и нейропротективной терапии при ишемии сердца и головного мозга.

Цель. Поиск ингибиторов NHE-1 среди новых производных хиназолина в исследованиях in vitro и прогноз ADMET свойств in silico.

Материалы и методы. Было изучено 4 соединения ВМА 22-12, 22-18, 22-34, 22-35 в диапазоне концентраций 1*10^-6-1*10^-8 М/л. Субстанции веществ предоставлены профессором кафедры фармацевтической и токсикологической химии, д.х.н. А.А.Озеровым.

В качестве препаратов сравнения были выбраны селективные ингибиторы Na⁺/H⁺- обменника 1 изоформы соединения амилорид и римепорид.

На первом этапе в исследованиях in vitro экспериментально изучали влияние анализируемых соединений и препаратов сравнения на изменения формы тромбоцитов в диапазоне концентраций 10^-8-10^-6 М.

Соединения ВМА 22-34, 22-35 в концентрации 10^-6М практически не оказали действия.

После того, как была выявлена активность потенциального лекарственного соединения, проводится оценка его фармакокинетических (ADME) и токсикологических характеристик. Это возможно сделать с помощью компьютерных программ и интернет-платформ, такие как SwissADME и ProTox II, они играют важную роль в начальной оценке фармакокинетических и токсикологических характеристик потенциальных лекарственных соединений. Эти инструменты позволяют проводить in silico прогнозы, основанные на химической структуре соединений и имеющихся данных о молекулах в базе.

Оценку достоверности данных in silico инструментов проводили путем сравнения полученных параметров амилорида и римепорида с данными из инструкции к препарату.

Амилорид не проникает через ГЭБ, обладает высокой биодоступностью и липофильностью, хорошо растворим в воде. Обладает меньшей кожной проницаемостью. Отсутствует влияние на цитохром Р₄₅₀.

По полученным данным римепорид не проникает через ГЭБ, хорошей биодоступностью и липофильностью, очень хорошо растворим в воде. Обладает меньшей кожной проницаемостью. Отсутствует влияние на цитохром Р₄₅₀.

Анализ сведений из ProTox II для амилорида показал, что возможно, обладает нейротоксичностью, мутагенностью. По данным ChEMBL^, вероятно, обладает метаболической токсичностью.

Результаты прогноза для ВМА 22-12 показали, что он не проникает через ГЭБ, обладает хорошей биодоступностью и липофильностью, очень хорошо растворим в воде. Обладает меньшей кожной проницаемостью. Отсутствует влияние на цитохром Р₄₅₀. Результаты прогноза пероральной специфической токсичности для ВМА 22-12 показали, что вещество имеет 3 класс токсичности с точностью прогноза 67,38%. Прогнозируемая ЛД₅₀ равна 160 мг/кг. Соединение вероятно обладает нейротоксичностью, респираторной токсичностью.

Результаты прогноза для ВМА 22-18 показали, что он не проникает через ГЭБ, обладает хорошей биодоступностью и липофильностью, очень хорошо растворим в воде. Обладает меньшей кожной проницаемостью. Отсутствует влияние на цитохром Р₄₅₀. Согласно расчетам ProTox ВМА 22-18 соединение имеет 3 класс токсичности с точностью прогноза 67,38%. Прогнозируемая ЛД₅₀ равна 160 мг/кг. Соединение вероятно обладает нейротоксичностью, респираторной токсичностью.

Результаты прогноза для ВМА 22-34 показали, что он не проникает через ГЭБ, обладает хорошей биодоступностью и липофильностью, очень хорошо растворим в воде. Обладает меньшей кожной проницаемостью. Отсутствует влияние на цитохром Р₄₅₀. Результаты прогноза пероральной специфической токсичности для ВМА 22-34 в ProTox показали, что вещество имеет 3 класс токсичности с точностью прогноза 67,38%. Прогнозируемая ЛД₅₀ равна 160 мг/кг. Соединение вероятно обладает нейротоксичностью, респираторной токсичностью.

Результаты прогноза для ВМА 22-35 показали, что он не проникает через ГЭБ, обладает хорошей биодоступностью и липофильностью, очень хорошо растворим в воде. Обладает меньшей кожной проницаемостью. Отсутствует влияние на цитохром Р₄₅₀. Согласно расчетам ProTox ВМА 22-35 вещество имеет 3 класс токсичности с точностью прогноза 54,26%. Прогнозируемая ЛД₅₀ равна 160 мг/кг. Соединение вероятно обладает нейротоксичностью, кардиотоксичностью.

Поскольку в нашем исследовании ни у одного соединения активность в исследуемом диапазоне концентрации не достигло 50% и выше, поэтому рассчитать IC₅₀ не создалось возможным. Наиболее активным соединением оказалось ВМА 22-18, эффект которого в концентрации 1*10^-6 М составил больше 20%. Для соединения ВМА 22-12 этот показатель составил 17%, а соединения ВМА 22-34, 22-35 практически не оказали действия.

Таким образом оказалось, что все производные хиназолина оказались статистически значимы менее активными по отношению к амилориду и римепориду.

Результаты

1. Проведен анализ современной отечественной и зарубежной литературы, посвященной изучению биологической активности ингибиторов Na⁺/H⁺ обмена. NHE-1 остается «привлекательной» мишенью для поиска новых цитопротекторных соединений.
2. Новые производные хиназолина в исследованиях in vitro на тромбоцитах кролика оказали умеренную NHE-1 ингибирующую активность. В концентрации 1х10^-6 М наибольший блокирующий эффект показали соединение ВМА 22-18 (23,31±2,14) и соединение ВМА 22-12 (17,49±6,14), однако статистически значимо уступают обоим препаратам сравнения.
3. По результатам прогноза ADMET свойств in silico в SwissADME было показано, что изученные производные хиназолина не проникают через ГЭБ. Обладают хорошей биодоступностью и липофильностью, растворимы в воде. Не ингибируют анализируемые веб-сайтом изоформы цитохрома Р₄₅₀. По результатам анализа в ProTox II все соединения можно отнести к 3 классу токсичности (предполагаемая ЛД₅₀ равна 160 мг/кг). Из прогнозируемых данных особое внимание стоит обратить на вероятность нейротоксического действия и респираторной токсичности.

Список литературы

1. Спасов А.А., Гурова Н.А., Харитонова М.С. Структура и биологическая роль NHE1. Фармакологическая регуляция активности // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2013. – Т. 71. – № 6. –с. 13-17.
2. Orlowski, John, and Sergio Grinstein. “Na+/H+ exchangers.” Comprehensive Physiology vol. 1,4 (2011): 2083-100. doi:10.1002/cphy.c110020
3. Pedersen, S F, and L Counillon. “The SLC9A-C Mammalian Na/H Exchanger Family: Molecules, Mechanisms, and Physiology.” Physiological reviews vol. 99,4 (2019): 2015-2113. doi:10.1152/physrev.00028.2018++
4. Kristensen SL, Preiss D, Jhund PS, Squire I, Cardoso JS, Merkely B, Martinez F, Starling RC, Desai AS, Lefkowitz MP, Rizkala AR, Rouleau JL, Shi VC, Solomon SD, Swedberg K, Zile MR, McMurray JJ, Packer M; PARADIGM-HF Investigators and Committees. Risk related to pre-diabetes mellitus and diabetes mellitus in heart failure with reduced ejection fraction: insights from Prospective Comparison of ARNI With ACEI to Determine Impact on Global Mortality and Morbidity in Heart Failure Trial.Circ Heart Fail. 2016; 9:e002560. doi: 10.1161/CIRCHEARTFAILURE.115.002560.
5. Packer M. (2017). Activation and Inhibition of Sodium-Hydrogen Exchanger Is a Mechanism That Links the Pathophysiology and Treatment of Diabetes Mellitus With That of Heart Failure. Circulation, 136(16), 1548–1559.
6. Lupachyk S, Stavniichuk R, Komissarenko JI, Drel VR, Obrosov AA, El-Remessy AB, Pacher P, Obrosova IG. Na+/H+-exchanger-1 inhibition counteracts diabetic cataract formation and retinal oxidative-nitrative stress and apoptosis.Int J Mol Med. 2012; 29:989–998. doi: 10.3892/ijmm.2012.933.
7. Parks, Scott K et al. “Genetic disruption of the pHi-regulating proteins Na+/H+ exchanger 1 (SLC9A1) and carbonic anhydrase 9 severely reduces growth of colon cancer cells.” Oncotarget vol. 8,6 (2017): 10225-10237.
8. Li, X., & Fliegel, L. (2022). Permissive role of Na+/H+ exchanger isoform 1 in migration and invasion of triple-negative basal-like breast cancer cells. Molecular and cellular biochemistry, 477(4), 1207–1216.