УДК 57.089

Визуализация имплантов на основе полиэфирных сополимеров методом МРТ

Лихов Астемир Ризуанович – студент факультета химической технологии и биотехнологии Московского политехнического университета

Демин Дмитрий Юрьевич – кандидат химических наук, научный сотрудник МИРЭА – Российского технологического университета

Володина Вероника Николаевна – младший научный сотрудник лаборатории молекулярного имиджинга Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук

Научный сотрудник Жердева Виктория Вячеславовна – научный руководитель, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярного имиджинга Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук

Аннотация: В статье описывается неинвазивный способ оценки биодеградации полиэфирных сополимеров, имплантированных мышам, с использованием магнитно-резонансной томографии (МРТ) с МР-контрастированием. Данные сополимеры планируется использовать при разработке имплантируемых трибоэлектрических наногенераторов. Материал включает описание получения сополимеров на основе пентадиола-1,5, пропиленгликоля и янтарной кислоты, процедуры имплантации полимеров лабораторным мышам линии Balb/c, методы получения изображений на установке 1Т М3™ МРТ (Aspect Imaging, Израиль), методы интерпретации изображений и постобработки, что позволяет проводить качественный и количественный анализ изучаемых объектов.

Ключевые слова: сополимер, ТЕНГ, визуализация, имплантация, МРТ, гадотерат.

Список сокращений

TR – time to repeat (время до повтора импульса)

TE – time to echo (время до ответа на импульс)

NEX-number of excitation (число импульсных повторов)

 возбуждения

FOV – field of view (поле зрения)

FA -flip angle (угол поворота)

Введение

Устройства, вырабатывающие трибоэлектроэнергию, обладают большим потенциалом для питания имплантируемых медицинских устройств, превращая механическую энергию вибраций и движения в электричество. Устройство типа трибоэлектрических генераторов (ТЭНГ) можно рассматривать как активный осциллирующий конденсатор, который накапливает электрический потенциал, а затем высвобождает его для питания диагностических и терапевтических устройств. [1]. Актуальность применения подобных устройств безбатарейного питания вызвана потребностями персонализированной медицины, в том числе в точной дозировке при доставке лекарств с минимальными потерями. При конструировании данных устройств предполагается широко использовать достижения нанотехнологий для создания биосовместимых и биоразлагаемых генераторов малых линейных размеров [2]. Одним из видов биодеградируемых материалов с трибоэлектрическими свойствами являются полиэфирные сополимеры, которые получают в том числе на основе различных комбинаций поли (l-молочной кислоты), поли (d, l-молочной кислоты), гликолевой кислоты. Присутствующие в живом организме эстеразы катализируют деградацию данных материалов [3,4]. Рост таких автономных трибоэлектрических устройств растет с каждым годом [5], и потребность в разработке методов, позволяющих в течение длительного срока изучать биосовместимость и скорость биодеградации этих материалов является на наш взгляд актуальной задачей.

В связи с этим в данной работе предлагается метод изучения биосовместимости и биодеградации потенциальных трибоэлектрических материалов на основе полиэфирных сополимеров при помощи неинвазивной визуализации.

Методы

Синтез и мечение полимеров

В качестве объекта исследований использовали полиэфирный сополимер, полученный на основе пентадиола-1,5, пропиленгликоля, янтарной кислоты, и лимонной кислоты, в качестве сшивающего агента.

image001

Схема 1. Синтез мономеров.

На первом этапе (схема 1) были синтезированы мономеры из пропиленгликоля и пентандиола реакцией с янтарным ангидридом в присутствии диизопропилэтиламина в среде ацетона. В круглодонную колбу объемом 500 мл помещали 15,2 г (0,2 моль) пропиленгликоля, 20,8 г (0,2 моль) пентандиола, 80 г (0,8 моль) янтарного ангидрида и 160 мл ацетона. Смесь нагревали до 55°С при перемешивании. Затем приливали растворенный в 60 мл ацетона диизопропилэтиламин (6 г). Смесь нагревали в течение 18 часов при 55°С. После протекания реакции из смеси упаривали ацетон и амин на вакуумном роторном испарителе. Смесь двухосновных кислот использовали далее без дополнительной очистки.

На втором этапе проводили олигомеризацию полиэфирного сополимера. В круглодонную колбу объемом 100 мл отмеряли 25.5 г смеси полученной на первом этапе, добавляли 30.1 г лимонной кислоты и 28 г пентандиола. Смесь нагревали до 100-140°С до тех пор, пока осадок не растворится и раствор не станет однородным. Затем раствор нагревали до 160°С в течение 1.5 часов, в процессе чего выделялась вода. Далее колбу с олигомером помещали на вакуумный роторный испаритель и упаривали воду в течение 3 часов при температуре 75°С и давлении около 10 мбар.

image002

Схема 2. Структура сополимера.

На третьем этапе в олигомер добавлялись метки и проводилась окончательная полимеризация на подложке. К 5 г олигомерной смолы (схема 2), полученной на этапе 2, добавляли 10-20 мл ацетона и тщательно перемешивали на магнитной мешалке до полного растворения олигомера. К полученному раствору добавляли раствор комплекса гадолиния (0.5 мл воды) и раствор флуоресцентной метки ICG (1мг) 0.5 мл смеси ацетона и воды. Смесь тщательно перемешивалась, а затем выливали на подложку из ПЭТ. Подложку помещали в чашку Петри и выдерживали ночь для испарения ацетона. На следующий день подложку нагревали до 100°С и выдерживали в течение 1-2 часов. После чего закрывали крышкой и продували аргоном. Полимеризацию проводили постепенным нагреванием при 140°С в течение 40 минут, при 160°С в течение 30 минут. После полимеризации закрытую чашку Петри охлаждали до комнатной температуры.

Приготовление хелатной формы гадолиния.
В пробирку Eppendorf объемом 1.5 мл отвешивали 4.8 мг GdCl3*6H2O и 7 мг лимонной кислоты и растворяли в 0.5 мл дистиллированной воды, затем добавляли 150 мкмоль р-ра KOH и выдерживали при 50°С в течение 3-5 часов.

Подготовка образцов полимеров к имплантации

Диски полимеров диаметром 5 мм получали путем выдавливания с помощью пауча. Диски стерилизовали в растворе 0,05% биглюконата хлоргексидина и 50 ЕД пенициллина/стрептомицина в течение 2 ч с последующим осушением в 80% растворе этанола.

Имплантация полимерных дисков

Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по биоэтике Научного центра биотехнологии РАН (протокол N◦23/1 от 16 июня 2022 г.) и проводились согласно соответствующим правилам использования животных.

Имплантацию полимерных дисков проводили мышам линии Balb/c (n=6) (питомник «Пущино»). Перед хирургической процедурой до подсадки материалов исследования животных визуализировали с применением МРТ для оценки картины нормальной анатомии тела животных.

Диски из полимера (диаметр 5 мм) подсаживали подкожно в стерильных условиях под анестезией (Анестезия смесью на основе 2,5 мкл Золетила 50 (Virbac,Франция) и 2, 5мкл Рометара 2% (Spofa Praha, Чехия) в продольные разрезы на деэпилированой дорсальной поверхности тела животных, контралатерально (т.е. 2 одинаковых диска на одно животное). Для закрытия ран использовали шовный материал «Монокрил».

Получение МР-изображений

 После снятия швов имиджинг животных проводился в течение месяца каждые 7-10дней МР-изображения получали на 1-ый, 10-ый,17-ый и 24-ый дни.

Магнито-резонансные изображения получали с использованием томографа М3™ МРТ, сконструированного на основе компактного высокоэффективного постоянного магнита с напряженностью магнитного поля 1 Тесла, который не требует криогенного обеспечения. Для исследований животное размещали на подложке съемного манипулятора в интегрированную радиочастотную катушку для тела (длина 50 мм, диаметр 38 мм), подключенной к установке газовой анестезии. В качестве ингаляционного наркоза использовали газовую смесь с регулируемой подачей изофлурана (1,5-2% изофлурана).

Изображения получали в трех проекциях (аксиальной, сагиттальной и фронтальной). Интенсивность сигнала парамагнитной метки хелатного комплекса цитрата гадолиния получали с использованием последовательности импульсов МРТ с использованием T2w FSE(T2-weigted fast spin echo), т.е. система импульсов быстрого спин эха с Т2-взвешиванием : TR/TE 4000/42, FOV 40x40 мм, матрица 128x128, ETL 8, NEX 4) и Т1wGRE T1(T1-weigted gradient echo), т.е. система импульсов 3-мерного градиент эха с Т1 взвешиванием (TR / TE = 60/ 3 мс, FA 20, NEX 7, FOV 40x40 мм, матрица 128х128)

МРТ сигнал измеряли с помощью анализа областей интереса (ROI- region of interest) в 6-ти или более томографических срезов толщиной 1 мм). Частота дыхания поддерживалась на уровне 30 дыхательных движений в минуту путем регуляции анестезии на минимально допустимом уровне. Встроенный триггер дыхания используется, чтобы минимизировать артефакты движения.

МРТ Т1 и Т2-взешенных изображений анализировали путем отбора 4-6 томографических срезов толщиной 1 мм. Изменения интенсивности сигнала определяли с помощью анализа изображений в формате TIFF с помощью Fiji /ImageJ [7]. Для просмотра изображений и получения трехмерных стэков использовали Versalius 3.0 (CTI, Бразилия) [8].

Результаты и обсуждение

На рисунке 1 представлены МР-изображения срезов области интереса в аксиальной проекции режиме T2w FSE: TR / TE 4000/42, FOV 40x40, матрица 128x128, NEX4), обработанные в программе Versalius 3.0.

image003

Рисунок 1. Выделение ROI-участков для определения интенсивности сигнала. Аксиальный срез МР-изображения в режиме T2w FSE ( TR/TE 4000/42, FOV 40x40 мм, матрица 128x128, ETL 8, NEX 4).

На рисунке 2 представлены изображение FOV в трех проекциях слева направо и сверху вниз: аксиальная, саггитальная, фронтальная и результирующее трехмерное изображение (рисунок 2-А). Зеленым цветом маркированы участки, соответствующие полимерным дискам. 3D изображение дает трехмерный вид имплантов. ROI получено с использованием ручного выделения (обведено желтым цветом) по границе гипоинтенсивного сигнала T2 взвешенного изображения (рисунок 2-Б).

image004

Рисунок 2. Получение 3D-изображения с использованием программы Versalius 3.0: А-аксиальная проекция; Б- сагиттальная проекция; В- корональная проекция; Г- трехмерная реконструкция изображения с аксиальной проекции.

На рисунке 3 представлено изменение аксиальных Т1 и Т2 средних значений интенсивности сигнала, рассчитанных по выделенной ROI в соответствии с примером рисунка 2-В на одном срезе на всем временном отрезке наблюдения.

На рисунке 3 представлены максимальные значения Т1 и Т2 интенсивности сигнала, рассчитанных по выделенной ROI (рисунок 1) для одного животного.

image005

Рисунок 3. Схематическая диаграмма магнитного резонанса T1 и T2 после имплантации полимерных дисков мышам. Аксиальный срез МР-изображения в режиме T2w FSE ( TR/TE 4000/42, FOV 40x40 мм, матрица 128x128, ETL 8, NEX 4) T1w GRE (TR / TE = 60/ 3 мс, FA 20, NEX 7, FOV 40x40 мм, матрица 128х128).

Сигнал магнитного резонанса исходит от релаксации протонов водорода молекул воды в диске, которая усиливается при использовании МР-контрастных агентов, в данном случае это хелат - цитрат гадолиния [6]. С 1-ого по 10 день наблюдается усиление интенсивности Т1, вероятно, вследствие набухания дисков, что визуализируется по увеличению их размеров на МРТ (данные не приведены). Набухание дисков может способствовать последующему гидролизу эфирных связей в диске. К 10 дню значения Т1 достигают максимума.

Последующая резорбция полимера характеризуется снижением количества метки и уменьшением размеров дисков (день 10-24) вокруг импланта. Снижение гипоинтенсивного Т2 также характеризует уменьшение размеров (резорбцию) дисков.

Таким образом, продемонстрирована возможность мониторинга деградациии полимеров с включенной в их состав меткой хелатного комплекса цитрата гадолиния in vivo по изменению сигналов T1 и T2w. Сочетание магнитно-резонасного имиджинга с флуоресцентным имиджингом является высокоинформативным инструментом для решения ряда задач [9]. Это позволит в дальнейшем вести мониторинг высвобождения флуоресцентной метки (индоцианинового зеленого). С помощью МРТ можно будет отслеживать изменения размеров импланта, а также физиологические реакции в окружающей ткани. 

Список литературы

  1. Sheng H. et al. Recent advances of energy solutions for implantable bioelectronics //Advanced Healthcare Materials. – 2021. – Т. 10. – №. – С. 2100199.
  2. Huang X. et al. Materials strategies and device architectures of emerging power supply devices for implantable bioelectronics //Small. – 2020. – Т. 16. – №. – С. 1902827.
  3. Korzhikov V. et al. Polyester-based microparticles of different hydrophobicity: the patterns of lipophilic drug entrapment and release //Journal of Microencapsulation. – 2016. – Т. 33. – №. – С. 199-208.
  4. Wcisłek A. et al. Enzymatic degradation of poly (butylene succinate) copolyesters synthesized with the use of Candida antarctica lipase B //Polymers. – 2018. – Т. 10. – №. – С. 688.
  5. Rahimi Sardo F. et al. Recent Progress of Triboelectric Nanogenerators for Biomedical Sensors: From Design to Application //Biosensors. – 2022. – Т. 12. – №. – С. 697.
  6. Rees J. A. et al. Evaluating the potential of chelation therapy to prevent and treat gadolinium deposition from MRI contrast agents //Scientific reports. – 2018. – Т. 8. – №. – С. 4419.
  7. Schindelin J. et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis //Nature methods. – 2012. – Т. 9. – №. – С. 676-682.
  8. InVesalius – An open-source imaging application. Thiago Franco de Moraes, Paulo Henrique Junqueira Amorim, Fábio de Souza Azevedo, Jorge Vicente Lopes da Silva. VIPIMAGE 2011, 2011, Algarve, Portugal. Computational Vision and Medical Image Processing. London: Taylor & Francis Group. 2011, v. 1, p. 405-408.
  9. Tuchina D. K. et al. Magnetic resonance contrast agents in optical clearing: Prospects for multimodal tissue imaging //Journal of Biophotonics. – 2020. – Т. 13. – №. – С. e201960249.

Интересная статья? Поделись ей с другими: