Влияние умеренной гипотермии и церебрамина на показатели свободнорадикальных процессов в мозге крыс в модели окклюзии сонных артерий
Гусейнов Герман Омарович – доцент кафедры Общей и биологической химии Дагестанского государственного медицинского университета Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Аннотация: Проведены исследования по влиянию различных эффектов умеренной гипотермии и церебрамина на критерии свободнорадикальных процессов в мозге крыс в модели окклюзии сонных артерий. В рамках окклюзии сонных артерий (ОСА) недостаточная активация различных ферментов, восстанавливающих формирующиеся гидроперекиси липидов, помогает накоплению ТБК-реактивных продуктов в мозге крыс. Во время гипотермии накопление различных ТБК-реактивных продуктов в коре больших полушарий оказалось выше, чем аналогичный процесс в стволовых структурах. При этом в модели ввода церебрамина перед ОСА, а также во время моделирования ОСА перед гипотермией уровень интенсивности окислительного стресса оказался ниже относительно животных, которым решили моделировать ОСА. Во время ввода церебрамина перед ОСА и дальнейшей гипотермии уровень интенсивности свободнорадикальных процессов оказался приближен к контролю. Сделали предположение о том, что сочетанное воздействие церебрамина и гипотермии способно оказать более значительное протекторное влияние на различные метаболические процессы в мозге крыс во время окклюзии сонных артерий относительно их раздельного использования. Выявлены региональные различия в области состояния антиоксидантного статуса (в коре больших полушарий и в стволовых структурах) в различных экспериментальных моделях.
Ключевые слова: Церебрамин, умеренная гипотермия, окклюзия сонных артерий, свободнорадикальные процессы.
Патофизиологической базой для развития реперфузионного и ишемического повреждений мозга крыс выступает нарушение в области кровоснабжения мозга [1]. При этом ишемия мозга крыс способна провоцировать энергетическое голодание в области ткани мозга, повреждение клеточных мембран мозга из-за высокой реактивности свободных радикалов, находящихся в мозге. В ходе таких изменений в нейронах и глиальных клетках коры мозга возникают нарушения процессов рецепторного связывания [3–4]. Ещё реперфузионные и ишемические изменения мозга крыс приводят к аккумуляции различных повреждений структуры ДНК в ходе окислительного стресса, что в последующем ведёт к запуску определённого процесса омертвления клетки [2]. Совокупность реакций, которые сопровождают различные ишемические/реперфузионные повреждения коры мозга, встречаются вместе с гипотермией, что способно усугубить уровень повреждений нейронов головного мозга [4].
Объектом изучения выступили 128 белых беспородных половозрелых крыс-самцов возрастом шести месяцев, обладающих массой 200–250 г. Крыс содержали в условиях вивария при соблюдении температуры на уровне +18–20°С на обычном рационе пропитания. Для того, чтобы избежать сезонных колебаний в области метаболизма и регуляции функций, опыты осуществляли в зимний период: декабрь – февраль.
Животных поделили на следующие категории: 1-я выборка – ложнооперированные крысы (л/о, контрольная выборка, n = 16). 2-я выборка – крысы, которым осуществляли перевязку правой сонной артерии (ПСА) на 3 минуты (с дальнейшей суточной реоксигенацией) и левой сонной артерии (ЛСА) на сутки (n = 16). 3-я выборка – крысы, которым перорально (per os) ввели церебрамин на протяжении 5 суток (кормление 1 раз в 24 часа в утренние часы) дозой 0,5 мг/кг с дальнейшим осуществлением ложной операции (n = 16). 4-я выборка – крысы которым до проведения 3-минутной окклюзии ПСА и суточной окклюзии ЛСА перорально ввели церебрамин дозой 0,5 мг/кг на протяжении 5 суток (n = 16). 5-я выборка – крысы, которых после осуществления ложной операции переводили в холодовую камеру с охлаждаемой водяной рубашкой, конструкция которой помогала регулировать степень охлаждения и постоянно отмечать термодатчиком ректальную температуру тела крысы с точностью до 0,010°С (n = 16). 6-я выборка – крысы, которых после осуществления 3-минутной окклюзии ПСА и суточной окклюзии ЛСА перемещали в холодовую камеру (n = 16). 7-я группа – крысы, которым перорально добавляли церебрамин на протяжении 5 дней. После осуществления ложной операции животных перемещали в холодовую камеру (n = 16). 8-я выборка – крысы, которым до осуществления 3-минутной окклюзии ПСА и суточной окклюзии ЛСА перорально добавляли церебрамин дозой 0,5 мг/кг на протяжении 5 дней. После осуществления операции крыс перемещали в холодовую камеру (n = 16).
Через сутки после проведения операции крыс декапитировали, мозг извлекли на холоде и выделили кору и стволовые структуры. Ишемизацию головного мозга моделировали с помощью перевязки левой сонной артерии на 24 часа и через минуту правой сонной артерии на 3 минуты с дальнейшей суточной реоксигенацией [2]. Гипотермию моделировали с помощью размещения крыс 5–7 выборок в холодовые камеры до той поры, пока ректальная температура животных не снижалась до 30°С (характерно для умеренной гипотермии). При этом температура воды в водяной рубашке составляла 8°С.
Содержание различных ТБК-реактивных продуктов выясняли флюориметрическим методом, рассмотренным А.В. Арутюнян и т.д. [1]. Активность глутатионпероксидазы выясняли по быстроте окисления восстановленного глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила по методике [8]. Выяснение концентрации ВГ осуществляли с помощью метода G.L. Ellman [6]. При этом активность глутатионредуктазы выявляли по быстроте окисления НАДФН2 методикой [3]. Выяснение активности глутатион-S-трансферазы осуществляли по методике, рассмотренной в пособии [6]. При этом активность каталазы выясняли с помощью методики М.А. Королюка.
В табл. 1–2 приведены данные по исследованию состояния про- и антиоксидантного статуса в головном мозге экспериментальных крыс. В модели окклюзии сонных артерий (2 выборка) обнаружено накопление гидроперекисей липидов и различных ТБК-реактивных продуктов в мозге животных на фоне увеличения активности ГПО и ГТ, а также уменьшения содержания ВГ по сравнению с контролем. Помимо этого, продемонстрировано уменьшение активности ГР в коре больших полушарий по сравнению с контрольной выборкой. Соответственно, в рамках окклюзии сонных артерий малая активация ферментов, призванных восстановить формирующиеся гидроперекиси липидов, помогает накоплению различных вторичных продуктов свободнорадикальных процессов (СРП) в структурах мозга крыс. Возможно, это выявлено в связи с сокращением синтеза ВГ и активности ГР в клетках в рамках развивающегося ацидоза в случае ишемии мозга.
Таблица 1. Воздействие церебрамина и гипотермии на содержание гидроперекисей липидов, ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП), восстановленного глутатиона (ВГ), активность каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионтрансферазы (ГТ), глутатионредуктазы (ГР) в коре больших полушарий подопытных крыс, (M ± m).
Примечание. * достоверные (р <0,05) отличия показателей по сравнению с контрольными значениями.
Таблица 2. Воздействие церебрамина и гипотермии на содержание гидроперекисей липидов, ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП), восстановленного глутатиона (ВГ), активность каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионтрансферазы (ГТ), глутатионредуктазы (ГР) в стволовых структурах мозга подопытных крыс, (M ± m).
Примечание. * достоверные (р <0,05) отличия показателей по сравнению с контрольными значениями.
Во время моделирования гипотермии (5 выборка) тоже отмечали увеличение содержания липоперекисей и ТБК- реактивных продуктов в структурах мозга крыс. При этом антиоксидантный статус в коре больших полушарий и стволовых структурах не был одинаков. В том числе в коре больших полушарий выявлено уменьшение уровня ВГ и активности ГР, тогда как в стволовых структурах на фоне уменьшения активности ГР и каталазы обнаружен рост активности ГТ и содержания ВГ по сравнению с контрольной выборкой. В итоге накопление вторичных продуктов СРП в коре больших полушарий оказалось выше, чем в стволовых структурах.
У крыс в модели окклюзии сонных артерий и дальнейшей гипотермии (6 категория) увеличение содержания липоперекисей в структурах мозга оказалось в меньшей степени выраженным по сравнению с животными, которым моделировали ОСА или гипотермию: в 6 категории животных существенное накопление различных первичных продуктов СРП выявили лишь в коре больших полушарий относительно контрольной выборки. Вместе с тем наблюдали увеличение активности ГПО и ГТ на фоне сокращения содержания ВГ в головном мозге. При этом подобные изменения осуществлялись при разноплановых изменениях активности ГР в структурах мозга: если в коре больших полушарий осуществлялось сокращение этого показателя, то в стволовых структурах – его увеличение относительно контрольной выборки. Ещё в стволовых структурах продемонстрировано увеличение каталазной активности в сравнении с 1-й выборкой животных. Итак, в этой модели проведения эксперимента определены особенности ответа антиоксидантного звена свободнорадикальных процессов в различных структурах мозга крыс : предотвращение излишней активации СРП в коре больших полушарий осуществляется на фоне роста антиоксидантной ёмкости ГПО и ГТ, тогда как в стволовых структурах – главным образом с помощью активации ГТ и каталазы. Известно, что сродство ГПО к пероксиду водорода выше, чем у каталазы, в связи с этим первая более успешно функционирует при невысоких концентрациях субстрата, в то же время при значительных концентрациях важнейшее значение отводится каталазе [7]. На самом деле, согласно полученным итогам исследования, как раз в коре больших полушарий осуществляется накопление гидроперекисей.
Во время ввода церебрамина (3 категория) рост содержания ТБК-реактивных продуктов осуществлялся лишь в коре больших полушарий животных относительно контрольной группы. Вместе с тем, продемонстрирован рост в структурах мозга ещё и уровня ВГ, активности ГТ и каталазы; в коре больших полушарий ещё выявлено увеличение активности ГПО. Рост про- и антиоксидантных звеньев свободнорадикальных процессов во время ввода пептидных препаратов связывают с особым их прекондиционирующим эффектом [5].
В рамках ввода церебрамина до моделирования ОСА (4 категория) в мозге обнаружено накопление липоперекисей и ТБК-реактивных продуктов, активности ГПО и ГТ относительно контрольной выборки. Ещё в коре больших полушарий оказалась уменьшена активность ГР и увеличена каталазная активность, при этом в стволовых структурах активность ГР оказалась выше контрольных значений. Соответственно, ввод церебрамина перед ОСА уменьшает интенсивность СРП в мозге крыс, при этом механизмы, находящиеся в основе такого явления, различны в коре больших полушарий и стволовых структурах: в коре больших полушарий значительную роль в уменьшении накопления продуктов СРП берут на себя различные ферменты, отличающиеся каталазной активностью, тогда как в стволовых структурах – глутатионтрансфераза.
Во время ввода церебрамина перед гипотермией (7 выборка) изменения различных показателей СРП определены лишь в стволовых структурах: осуществлялось увеличение уровня липоперекисей и активности глутатионтрансферазы по сравнению с контролем. В модели ввода ноотропа перед ОСА и моделированием гипотермии (8 выборка) тоже обнаружены небольшие отклонения от контрольных значений в состоянии СРП. Например, в коре больших полушарий продемонстрировано накопление липоперекисей на фоне уменьшения активности ГР, а также активности ГПО (0,1 < р < 0,05); в стволовых структурах отмечали только увеличение активности ГТ.
Итак, сочетанное воздействия церебрамина и гипотермии способно оказать более значительное протекторное действие на различные метаболические процессы в структурах мозга животных во время окклюзии сонных артерий, чем их раздельное использование в виде факторов, уменьшающих эффекты ишемии мозга крыс. Кроме того, определены региональные различия особых защитных механизмов против дальнейшего развития окислительного повреждения мозговой ткани.
Список литературы
- Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. – М., 2001. – 328 с.
- Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньщикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков и др. – М.: Слово, 2006. – 556 с.
- Эмирбеков Э.З., Пашаева М.Э., Эмирбекова А.А. Молекулярные процессы в мозге при принудительной гипотермии. – Ростов-на-Дону: Изд-во Южного федерального университета, 2012. – 122 с.
- Эмирбеков Э.З., Айдунбеков Ф.Т. Влияние гипотермии и церебрамина на содержание моноаминов в мозге и крови крыс при окклюзии сонных артерий // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. – 2009. – № 4. – С. 78–81.
- Эмирбеков Э.З., Айдунбеков Ф.Т. Влияние сочетанного воздействия гипотермии, церебрамина и окклюзии сонных артерий на баланс аминокислотных нейротрансмиттеров в мозге крыс // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. – 2009. – № 1. – С. 70–73.
- Ji X., Luo Y., Ling F. et al. Mild hypothermia diminishes oxidative DNA damage and pro-death signaling events after cerebral ischemia: a mechanism for neuroprotection. // Front Biosci. – 2007. – Vol. 12. – Р. 1737–1747.
- Luo Y., Ling F., Li W. et al. Impaired DNA Repair Via the Base-excision Repair Pathway After Focal Ischemic Brain Injury: a Protein Phosphorylation-dependent Mechanism Reversed by hypothermic Neuroprotection // Front Biosci. – 2007. – Vol. 12. – P. 1852–1862.
- Noor R., Wang C.X., Shuaib A. Hyperthermia Masks the Neuroprotective Effects of Tissue Plasminogen Activator // Stroke. – 2005. – Vol. 36. – P. 665–669.
- Van Hemelrijck A., Hachimi-Idrissi S., Sarre S. et al. Post-ischemic Mild Hypothermia Inhibits Apoptosis in the Penumbral Region by reducing neuronal Nitric Oxide Synthase Activity and Thereby Preventing Endothelin-1-induced Hydroxyl Radical Formation // Eur. J. Neurosci. – 2005. – Vol. 22. – № 6. – P. 1327–1337.