УДК 61

Сравнительное изучение максимальной толерантной дозы перфторорганических эмульсий

Аршинцева Елена Валентиновна – технолог ООО «Эмульсии медицинские».

Пушкин Сергей Юрьевич – директор ООО «Эмульсии медицинские».

Аннотация: Проведенное исследование по изучению максимальной толерантной дозы при внутривенном введении крысам показало, что ПФО-эмульсия, не содержащая быстровыводящиеся перфторорганические соединения, вызывает меньшие клинические проявления нарушения здоровья, а также эти токсические явления длятся в два раза меньше по сравнению с эмульсией содержащей быстровыводящиеся перфторорганические соединения.

Ключевые слова: ПФО-эмульсия, перфторан, перфторорганические соединения, токсичность.

1. Введение

Ярким примером удачного компромиссного решения между кислородной емкостью кровезаменителя, его токсичностью и эффективностью является Перфторан, который был зарегистрирован не только в стране своего происхождения, но и в других странах [1]. Но несмотря ни на что, реактогенность этой эмульсии оценивается от 1 до 10-15% [2, 3].

Оказалось, что на токсичность эмульсии влияет не только токсичность химических веществ, входящих в эмульсию, но и размер частиц эмульсии, гомогенность эмульсии [4], скорость выведения эмульсии из кровеносного русла, время удержания, в первую очередь это касается ПФО-соединений, в печени [5], и некоторые другие факторы.

Например, ПФО-соединение перфтордекалин не токсичное для человека вещество, оно широко применяется в офтальмологии при витреоретинальных операциях [6], жидкостном дыхании [7], а также при применении мазей от ожогов [8] и косметологических кремов [9]. Но внутривенные эмульсии на основе только ПФД чрезвычайно токсичны для животных крупнее крыс, например кроликов [10, 11, 12].

Для решения этой проблемы стали изготавливать эмульсии из двух ПФО-соединений: быстровыводящихся (ПФД, ПФОБ) и медленновыводящихся (ПМЦП, ПФТБА) [2, 13].

Также исследователи обратили внимание, что и средний размер частиц эмульсии влияет на токсичность, особенно на такое её проявление, как реактогенность. Было обнаруженно, что для уменьшения проявлений реактогенности средний размер частиц не должен превышать 150 нм [14], но разработчики препарата Oxycyte считают нормальным средний размер частиц 200-300 нм [15].

Согласно инструкции по применению при лечении острой кровопотери и шока Перфторан вводят внутривенно капельно или струйно в дозе от 5 до 30 мл ⁄ кг массы тела [16], что составляет при среднем весе больного 70 кг от 350 до 2100 мл.

Исследователи также показали, что выведение медленновыводящегося ПФО-соединения ПМЦП при внутривенном введении кровезаменителя Перфторан в дозах 10-20 мл/кг составляет 6-8 месяцев против 18 месяцев у крыс [5].

Клинический опыт показал, что максимальная доза введения 30 мл/кг или даже 46 мл/кг (3200 мл) необходима в крайне редких случаях [5], доза введения 20 мл/кг также редко востребована [17].

А проведенное статистическое исследование среди лечебных учреждений, применяющих Перфторан, показало, что среднее количество введенной эмульсии составляет 321,6 мл или 4,6 мл/кг, а специалисты Кемеровского центра медицины катастроф сделали заключение, что перфторан наиболее целесообразно вводить по 200 мл в течение первых-вторых суток или 2,86 мл/кг в сутки [17, 18]. Данный показатель меньше минимальной терапевтической дозы Перфторана, но терапевтический эффект от его применения не уменьшился [19]. И другие данные подтверждают эффективность эмульсии Перфторан даже в дозах от 1,5 до 2 мл/кг [20].

Авторы статьи сделали предположение, что для снижения токсичности эмульсии необходимо совсем отказаться от быстровыводящегося ПФД.

В качестве полоксамера для экспериментальной эмульсии был взят полоксамер 188. Состав ПФО-эмульсий Оксифтэм и дженерика Перфторана представлены в таблице 1.

Таблица 1. Сравнительный состав контрольной и экспериментальной ПФО-эмульсий.

При изготовлении опытной партии эмульсии Оксифтэм использовали такую же технологию производства, как и для изготовления кровезаменителя Перфторан [21].

Замер среднего размера частиц экспериментальной эмульсии делали на Beckman Coulter N5 Submicron Particle Size Analyzer, Japan. На этом же приборе измеряли средний размер дженерика Перфторана.

Средний размер дженерика Перфторан получился 135,7 нм, а у эмульсии Оксифтэм 6,3 нм. Графики распределения представлены на рис.1 и 2 соответственно.

Рисунок 1. График распределения частиц дженерика Перфторана.

Рисунок 2. График распределения частиц эмульсии Оксифтэм.

Расчет поверхности газообмена этих двух ПФО-эмульсий в сравнении с эритроцитом представлен в таблице 2.

Таблица 2. Общая площадь поверхности частиц ПФО-эмульсий и эритроцита.

Несмотря на то, что в экспериментальной эмульсии количество ПФО-соединений почти в 4 раза меньше, чем у дженерика Перфторана, из-за громадной разницы в размерах частиц эмульсии, общая поверхность газообмена эмульсии Оксифтэм в 5,5 раз больше, чем у Перфторана. А этот показатель очень сильно влияет на эффективную поверхность и динамику газообмена в кровеносном русле, что выгодно выделяет ПФО-эмульсии от других кровезаменителей [22, 23].

Для подтверждения гипотезы, что исключение ПФД из состава эмульсии приведет к уменьшению токсических проявлений, в частности реактогенности, был проведен эксперимент по изучению максимальной толерантной дозы (МТД) при однократном внутривенном введении крысам.

Исследование проводилось в Лаборатории биологических испытаний ФИБХ РАН, которая имеет аккредитацию Международной ассоциации по оценке и аккредитации работы с лабораторными животными (AAALAC International) и официально признана на соответствие принципам надлежащей лабораторной практики (GLP) Словацкой национальной службой по аккредитации и Российским органом мониторинга – Федеральной службой по аккредитации.

2. Материалы и методы

2.1 Экспериментальная эмульсия

В качестве экспериментальной эмульсии использовали ПФО-эмульсию Оксифтем (Oxyphtem), которая содержит одно ПФО-соединение ПМЦП, полоксамер 188 и солевую композицию.

В качестве полоксамера 188 использовали вещество Kolliphor P188 серии GND10221B, бесплатно предоставленного компанией BASF, Германия.

Экспериментальная эмульсия была изготовлена по договору НИОКР с Лабораторией энергетики биологических систем ИТЭБ РАН.

2.2 ПФО-эмульсия в качестве контроля

В качестве контроля использовался дженерик Перфторана, основными компонентами которого являются два ПФО-соединения (ПФД и ПМЦП), полоксамер Эмуксол 268 марки А и солевая композиция.

Необходимое количество ПФО-эмульсии дженерика Перфторана для исследования предоставила Лаборатория энергетики биологических систем ИТЭБ РАН.

2.3 Животные

В исследовании использовались самки белых аутбредных крыс линии SD (Sprague-Dawley) массой тела 194±14 г возрастом к началу введения 6–8 недель в количестве 12 особей.

Животные получены из НПП ФИБХ РАН питомника лабораторных животных «Пущино» в возрасте 5-6 недель. Производитель животных предоставил данные последнего контроля здоровья животных, подтверждающие их SPF-статус (животные, свободные от определенных патогенов). При получении был проведен внешний осмотр состояния животных.

Полученные животные до начала исследования были помещены в комнату содержания животных барьерного типа 1.4 на период адаптации при групповом содержании в клетке (по 5-10 особей в зависимости от массы тела в клетки Тип-4, 1815 кв. см). Во время этого периода у животных контролировали проявление признаков отклонения в состоянии здоровья.

В эксперимент были отобраны животные без признаков отклонений здоровья (делался клинический осмотр). Животных распределяли по группам с применением принципа рандомизации, используя в качестве критерия массу тела, так, чтобы средняя масса тела животных к 1-му дню введения статистически не отличалась между группами.

Каждому животному был присвоен индивидуальный номер, в соответствии с которым животному ставилась метка проколом ушной раковины. На этикетке клетки указывали группу, номер животного, метку, код исследования, Ф.И.О. руководителя, номер протокола IACUC.

Животные содержались в комнате содержания животных барьерного типа. За стандарты содержания животных приняты стандарты, определенные Директивой 2010/63/EU по защите животных, используемых в научных целях. В качестве приемлемых границ параметров микроклимата в комнатах содержания животных приняты границы, определенные руководством The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington D.C., 2011): температура 20-24°C, относительная влажность 30-55%, 12 часовой цикл освещения (08:00-20:00 – «день», 20:00-08:00 – «ночь») и, по крайней мере, 10-ти кратная смена объема воздуха комнаты в час). Температура и влажность постоянно контролировались в каждой комнате содержания животных автоматически с помощью системы Eksis Visual Lab (EVL, ОАО «Практик-НЦ»).

Во время эксперимента животные содержались по 2 особи в клетках Тип-4 (1815 кв. см) на подстиле. Поликарбонатные клетки оборудовались стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением, стальными разделителями для корма и стальными держателями этикеток. В клетки давался дополнительно материал обогащения окружающей среды (древесные волокна Lignocel Nesting large, JRS, Germany).

В качестве корма использовался гранулированный корм полнорационный для содержания крыс и мышей Mmucedola Standard Diet 4RF21 (автоклавируемый), который давался ad libitum в кормовое углубление крышки клетки.

Специально подготовленная с помощью установки Milli-RO (Millipore) вода давалась ad libitum в стандартных автоклавированных питьевых бутылочках со стальными крышками-носиками. Подготовка воды обеспечивает отсутствие контаминации, способной повлиять на результаты исследования.

Животных не лишали корма на протяжении всего исследования.

2.4 Процедура введения препаратов

Тестируемые препараты вводили внутривенно в 2 этапа в объеме 10 мл/кг с интервалом 6-8 ч. Для расчета индивидуального объема введения использовали последнее значение массы тела животного. Введение препаратов осуществляли согласно графику процедур в одно время суток (с 09:00-13:00).

2.5 Наблюдения и измерения в ходе исследования

Наблюдение за животными для выявления отклонений в состоянии здоровья и смертности проводили в течение первых 3-х часов после введения и далее ежедневно в первой половине дня.

Подробный клинический осмотр каждого животного проводился при формировании групп, перед введением тестируемых препаратов, непосредственно после введения через 1, 24 и 48 часов в соответствии с СОП Am/16 «Клинический осмотр».

Масса тела регистрировалась при формировании групп, непосредственно перед введением, и через 24 и 48 часов после введения препарата (СОП Am/5).

2.6 Патоморфология и гистология

В конце исследования (через 14 дней после введения веществ) всех животных подвергали плановой эвтаназии. Животное помещали в CO2-камеру до первых признаков смерти.

Всех животных вскрывали. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренних поверхностей и проходов, полости черепа, грудной, брюшной и тазовой полостей с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями, каркас и скелетно-мышечную систему. Коллекция органов и тканей не производилась.

2.7 Статистический анализ

Для всех количественных данных была применена описательная статистика: подсчитаны среднее значение и стандартное отклонение, которые вместе со значением N (количество вариант в группе) представлены в таблицах. Для установления межгрупповых различий данные массы тела, прироста массы тела были проанализированы многофакторным дисперсионным анализом ANOVA-2 с последующим тестом Duncan. Статистический анализ проводили с использованием программы Statistica 7.1. Различия определяли при 5%-ном уровне значимости.

3. Результаты

3.1 Результаты введения

Отклонений в процедуре введения не было.

На протяжении всего исследования ни в одной экспериментальной группе гибели животных не было.

У всех животных, внутривенно получавших Дженерик Перфторана в течение 30 мин после первого введения наблюдались следующие клинические признаки: прикрытие век, снижение локомоторной активности, нарушение координации движения. По прошествии 30 мин после введения и в дальнейшем клинических признаков нарушения здоровья животных обнаружено не было.

У всех животных, внутривенно получавших Оксифтем в течение 15 мин после первого введения наблюдались признаки местно-раздражающего действия, проявляющегося в активном расчесывании кожных покровов и покусывании передних и задних конечностей. По прошествии 15 мин после введения и в дальнейшем клинических признаков нарушения здоровья животных обнаружено не было.

Повторное введение препаратов Дженерик Перфторана и Оксифтем не вызвало у животных клинических проявлений.

Описанные выше клинические признаки связаны с действием тестируемых веществ.

3.2. Масса тела

Средние значения по группам начальной массы тела, массы тела в конце периода введения и общий прирост указаны в Таблице 3.

Таблица 3. Масса тела и прирост массы тела.

3.3 Патоморфология. Результаты некропсии

При плановой некропсии животных, в ходе визуального осмотра внешнего состояния тела, внутренних поверхностей и проходов, полости черепа, грудной, брюшной и тазовой полостей с находящимися в них органами и тканями, шеи с органами и тканями, каркаса и скелетно-мышечной системы, макроскопических изменений, связанных с действием вводимых препаратов, выявлено не было ни у животных, внутривенно получавших Дженерик Перфторана, ни у животных, внутривенно получавших Оксифтем.

4. Заключение

В ходе исследования была определена максимальная толерантная доза для препаратов Дженерик Перфторана и Оксифтем при их внутривенном введении самкам крыс. При внутривенном введении максимального суточного объема (20 мл/кг, вводимые в 2 этапа по 10 мл/кг с интервалом 6-8ч) тестируемых веществ не происходило гибели ни в одной группе из 6 животных.

Токсический эффект от внутривенного введения эмульсии Оксифтем проявлялся слабее и имел меньшую продолжительность, чем эффект от внутривенного введения эмульсии Дженерик Перфторана, что подтверждает гипотезу авторов об уменьшении токсических свойств новой эмульсии за счет исключения из состава перфтордекалина.

Список литературы

1. Маевский Е.И., Головненкова А.Е., Алексеев С.В. и др. Перфторан. Неиспользованный потенциал медицины против covid-19 // ru. Российский биомедицинский журнал. – 2020. – Т. 21. – С. 854-869.
2. Маевский Е. И. Возможные причины острой реактогенности эмульсии перфторуглеродов. Часть 1. Перфторан // Известия Института инженерной физики. – 2016. – № 1(39). – С. 79-87.
3. Моисеенко О.М. Автореферат диссертации по медицине на тему «Экспериментально-клиническое обоснование применения препарата перфторан в лечении геморрагической, воспалительной и дистрофической патологии глаза», Москва, 2007
4. Пушкин С.Ю., Погорелова В.Н., Маевский Е.И., Масленников И.А., Мазенко И.В., Деев А.А. Анализ дисперсности препарата "ПЕРФТОРАН". //Перфторуглеродные соединения в экспериментальной и клинической медицине. Сборник материалов Российской научной конференции, С-Пб, 2004, С.101-102.
5. Крылов Н.Л., Мороз В.В., Иваницкий Г.Р., Голубев А.М., Маевский Е.И. О путях и сроках выведения перфторорганических соединений (ПФОС) из организма животных и человека.// "Перфторуглеродные соединения в биологии и медицине", материалы научной конференции, Пущино, 1998 г.
6. Куликов В.С. Случай длительного пребывания перфтордекалина под сетчаткой // Офтальмологические ведомости. Том I № 2 2008, с. 68-69.
7. Котский М. А., Бонитенко Е. Ю., Макаров А. Ф. и др. О возможности использования жидкостного дыхания для профилактики развития декомпрессионных нарушений // Медицина труда и промышленная экология. – 2022. – Т. 62. – № 2. – С. 91-100.
8. Осипов А.П., Горшков Ю.В., Любимов А.Н., Абрамов О.Б. Применение перфторорганических соединений (ПФОС) при лечении больных с ожогами. В книге: «Материалы XX съезда хирургов Украины», том 2 – Тернополь, 2002, стр.659-660.
9. Пушкин С.Ю. ПФО-коррекция – новый подход к решению проблем, связанных с выпадением волос // Интернет-журнал о коммерческих биотехнологиях cbio.ru, 15.09.2017
10. Schutt, P. Barber, T. Fields, S. Flaim, J. Horodniak, P. Keipert, R. Kinner, L. Kornbrust, T. Leakakos, T. Pelura, J. Weers, R. Houmes & B. Lachmann (1994) Proposed Mechanism of Pulmonary Gas Trapping (Pgt) Following Intravenous Perfluorocarbon Emulsion Administration, Artificial Cells, Blood Substitutes, and Biotechnology, 22:4, 1205-1214,
11. Leland C. Clark Jr., Richard E. Hoffmann, Robert B. Spokane & Pat E. Winston. Physiological Evaluation of Fluorocarbon Emulsions with Notes on F-Decalin and Pulmonary Inflation in the Rabbit // MRS Online Proceedings Library, volume 110, pages129–134 (1987)
12. Склифас А.Н., Образцов В.В., Макаров К.Н. и др. Исследование механизма токсичности эмульсий перфтордекалина для кроликов. // В сб. «Перфторуглеродные активные среды для медицины и биологии (новые аспекты исследования». 1993, Пущино, с.129-135.
13. Склифас, А. Н. Исследование механизмов аккумуляции и выведения перфторорганических соединений в организме животных: специальность 03.00.02: диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук / Склифас Алла Николаевна. – Пущино, 2000. – 118 с.
14. Щукин Е.Д., Маркина З.Н. и др. Об эмульгирующей способности низкомолекулярных ПАВ по отношению к перфторуглеродам в водной среде. // Фторуглеродные газопереносящие среды. Сборник научных трудов по редакцией проф. Белоярцева Ф.Ф. – Пущино, 1984, с. 63-70.
15. United States Patent Application Publication 2010/0267842. Emulsions of Perfluorocarbons / Richard Kiral et al., Tenax Therapeutics Inc, Pub. Date Oct. 21, 2010.
16. Инструкция по применению Перфторана
17. Бондарь О.Г., Пушкин С.Ю., Шкуропатов Ю.Ф. и др. Перфторан спасает жизни // Фармацевтический вестник Татарстана, №12 (290), с.17, 11 апреля 2007.
18. Вечерко А.В., Глущенко Ю.И., Зараев А.А. и др. Применение Перфторана в лечебной практике (по результатам анкетирования) // Трансфузиология.- 2003.- Т.1, №4.- с.54-56.
19. Жибурт Е.Б., Масленников И.А., Пушкин С.Ю. и др. Применение перфторана в лечебной практике (по результатам анкетирования).//Трансфузиология, 2005, Т.6, № 4, с.63-74.
20. Орлов А.А. Клинико-экспериментальное обоснование применения перфторана в челюстно-лицевой хирургии: доктор медицинских наук. Тема диссертации по ВАК РФ 14.00.21, Московский государственный медико-стоматологический университет, Москва – 2005, 207 с.
21. Патент № 2557933 C1 Российская Федерация, МПК A61K 31/02, A61K 9/107, A61P 7/08. Способ приготовления стерильной наноэмульсии перфторорганических соединений : № 2014106582/15 : заявл. 27.03.2014 : опубл. 27.07.2015 / С. Ю. Пушкин.
22. Иваницкий Г.Р. Биофизика на пороге нового тысячелетия. Перфторуглеродные среды и газотранспортные кровезаменители. // Medline.ru. Российский биомедицинский журнал. Том 1, СТ. 1 (стр. 1-24) // Декабрь, 2000.
23. Баховадинов Б.Б., Барышев Б.А. Кровезаменители. Компоненты крови. Посттрансфузионные реакции и осложнения // Справочник для врачей. Типография ООО «Оптима». Санкт-Петербург – 2018, 288 с.