УДК 61
Заводский Роман Юрьевич – студент кафедры Гигиены и экологии Новосибирского государственного медицинского университета.
Аннотация: На стадии посттрансфекционного анализа клеток имеется несколько способов оценки степени успешности проведенной трансфекции. Одним из таких способов является ПЦР в реальном времени, позволяющая измерить относительные изменения в экспрессии какого-либо гена. Данный метод может применяться и для оценки экспрессии трансфецированного рекомбинантного гена, аналог которого присутствует в геноме и активно экспрессируется.
Ключевые слова: ПЦР в реальном времени, анализ относительной экспрессии генов, трансфекция.
Полимеразная цепная реакция является одной из самый мощных технологий в молекулярной биологии. При помощи ПЦР специфические последовательности внутри кДНК могут быть амплифицированы миллионы раз при помощи последовательность-специфичных олигонуклеотидов, термостабильной ДНК-полимеразы и термоциклера. В традиционной ПЦР обнаружение и подсчет амплифицированной последовательности выполняются в конце реакции на последнем её цикле и включают в себя пост-ПЦР анализ, такой как электрофорез в геле и исследование полученного изображения. В ПЦР в реальном времени же ПЦР продукт и его количество измеряются каждый цикл [3].
Сегодня ПЦР в реальном времени стала одной из самых широко используемых техник подсчета экспрессии генов из-за своего широкого динамического диапазона, высокой чувствительности, отсутствие трудозатратной постреакционной обработки данных. Важным является как метод оценки экспрессии генов - абсолютное или относительное измерение экспрессии, так и математическая методика обработки полученных данных, что учитывала бы вариации между биологическими и техническими повторами при выполнении реакции [2].
Главный аналитический показатель ПЦР в реальном времени - значение порогового цикла реакции Сt, который позволяет эффективно оценить относительную экспрессию исследуемых клеточных генов, может быть измерен и для анализа экспрессии рекомбинантных генов плазмиды, трансфекцию которой провели для исследуемых клеток. В данной случае выбор пал на CCR9 и его рекомбинантный аналог, закодированный в плазмиде; целью же для трансфекции стали дендритные клетки.
С целью доказательства валидности метода ПЦР в реальном времени для посттрансфекционноого анализа клеток было произведено измерение Ct для генов Pgk1, клеточного CCR9 и транскрибированного с плазмиды CCR9 в электропорированных дендритных клетках, Pgk1 (Рис. 1), выступал в роли гена домашнего хозяйства гена, который в виду постоянства своей экспрессии может быть применен как нормализующий фактор для относительного уровня экспрессии целевого гена, из-за чего такие гены получили название референсных [1], а клеточный (Рис. 2) и экспрессируемый плазмидой (Рис. 3) CCR9 суммарно отражали тотальный уровень CCR9 в трансфицированных дендритных клетках. Полученные значения Ct были обработаны ∆∆Ct методом для оценки относительной нормализованной экспрессии.
В процессе исследования были использованы актуальные гайдлайны для проведения ПЦР в реальном времени [4].
Рисунок 1. Отношение RFU (относительных единиц флуоресценции) к числу циклов амплификации для гена Pgk1.
Рисунок 2. Отношение RFU к числу циклов амплификации для гена CCR9, транскрибированного с клеточной ДНК.
Рисунок 3. Отношение RFU к числу циклов амплификации для гена CCR9, транскрибированного с плазмиды.
Выводы: Полученные данные показали увеличение суммарной экспрессии клеточного и рекомбинантного CCR9 в 23,7 раза для трансфицированных клеток, что позволяет заявить об эффективности метода ПЦР в реальном времени в оценке успешности трансфекции плазмидой с трансгеном.
Список литературы