gototopgototop

УДК 61

Измерение суммарной экспрессии клеточного и рекомбинантного вариантов гена как способ посттрансфекционного анализа клеток

Заводский Роман Юрьевич – студент кафедры Гигиены и экологии Новосибирского государственного медицинского университета.

Аннотация: На стадии посттрансфекционного анализа клеток имеется несколько способов оценки степени успешности проведенной трансфекции. Одним из таких способов является ПЦР в реальном времени, позволяющая измерить относительные изменения в экспрессии какого-либо гена. Данный метод может применяться и для оценки экспрессии трансфецированного рекомбинантного гена, аналог которого присутствует в геноме и активно экспрессируется.

Ключевые слова: ПЦР в реальном времени, анализ относительной экспрессии генов, трансфекция.

Полимеразная цепная реакция является одной из самый мощных технологий в молекулярной биологии. При помощи ПЦР специфические последовательности внутри кДНК могут быть амплифицированы миллионы раз при помощи последовательность-специфичных олигонуклеотидов, термостабильной ДНК-полимеразы и термоциклера. В традиционной ПЦР обнаружение и подсчет амплифицированной последовательности выполняются в конце реакции на последнем её цикле и включают в себя пост-ПЦР анализ, такой как электрофорез в геле и исследование полученного изображения. В ПЦР в реальном времени же ПЦР продукт и его количество измеряются каждый цикл [3].

Сегодня ПЦР в реальном времени стала одной из самых широко используемых техник подсчета экспрессии генов из-за своего широкого динамического диапазона, высокой чувствительности, отсутствие трудозатратной постреакционной обработки данных. Важным является как метод оценки экспрессии генов - абсолютное или относительное измерение экспрессии, так и математическая методика обработки полученных данных, что учитывала бы вариации между биологическими и техническими повторами при выполнении реакции [2].

Главный аналитический показатель ПЦР в реальном времени - значение порогового цикла реакции Сt, который позволяет эффективно оценить относительную экспрессию исследуемых клеточных генов, может быть измерен и для анализа экспрессии рекомбинантных генов плазмиды, трансфекцию которой провели для исследуемых клеток. В данной случае выбор пал на CCR9 и его рекомбинантный аналог, закодированный в плазмиде; целью же для трансфекции стали дендритные клетки.

С целью доказательства валидности метода ПЦР в реальном времени для посттрансфекционноого анализа клеток было произведено измерение Ct для генов Pgk1, клеточного CCR9 и транскрибированного с плазмиды CCR9 в электропорированных дендритных клетках, Pgk1 (Рис. 1), выступал в роли гена домашнего хозяйства гена, который в виду постоянства своей экспрессии может быть применен как нормализующий фактор для относительного уровня экспрессии целевого гена, из-за чего такие гены получили название референсных [1], а клеточный (Рис. 2) и экспрессируемый плазмидой (Рис. 3) CCR9 суммарно отражали тотальный уровень CCR9 в трансфицированных дендритных клетках. Полученные значения Ct были обработаны ∆∆Ct методом для оценки относительной нормализованной экспрессии.

 В процессе исследования были использованы актуальные гайдлайны для проведения ПЦР в реальном времени [4].

1

Рисунок 1. Отношение RFU (относительных единиц флуоресценции) к числу циклов амплификации для гена Pgk1.

2

Рисунок 2. Отношение RFU к числу циклов амплификации для гена CCR9, транскрибированного с клеточной ДНК.

3

Рисунок 3. Отношение RFU к числу циклов амплификации для гена CCR9, транскрибированного с плазмиды.

Выводы: Полученные данные показали увеличение суммарной экспрессии клеточного и рекомбинантного CCR9 в 23,7 раза для трансфицированных клеток, что позволяет заявить об эффективности метода ПЦР в реальном времени в оценке успешности трансфекции плазмидой с трансгеном.

Список литературы

  1. Bartłomiej Kozera, Marcin Rapacz. Reference genes in real-time PCR // Journal of applied Genetics. — 2013. — № 54. P. 391–406. [https://link.springer.com] — Режим доступа. — URL: https://link.springer.com/article/10.1007/s13353-013-0173-x (дата обращения 09.06.2020).
  2. Marisa L. Wong, Juan F. Medrano. Real-time PCR for mRNA quantitation // BioTechnique. — 2005. — № 39. P. 75-85. [https://www.future-science.com] — Режим доступа. — URL: https://www.future-science.com/doi/pdf/10.2144/05391RV01 (дата обращения 09.06.2020).
  3. Real-time PCR handbook // Сайт компании Thermofisher Scientific. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf (Дата обращения 09.06.2020).
  4. Sean C. Taylor, Katia Nadeau, Meysam Abbasi, Claude Lachance, Marie Nguyen, Joshua Fenrich. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time // Trends in biotechnology. — 2019. — № 37. P. 761-774. [https://www.cell.com] — Режим доступа. — URL: https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S0167-7799%2818%2930342-1 (дата обращения 09.06.2020).

Интересная статья? Поделись ей с другими:

Внимание, откроется в новом окне. PDFПечатьE-mail