УДК 616.36

Морфологические признаки течения апоптоза в гепатоцитах человека и некоторых животных

Азизова Феруза Хусановна – доктор медицинских наук, профессор Ташкентской медицинской академии (Республика Узбекистан).

Убайдуллаева Муборакхон Асомиддин кизи – магистр Ташкентской медицинской академии (Республика Узбекистан).

Аннотация: В клетках печени существует определенный жизненный цикл, по истечению которого клетки подвергаются естественной гибели. О механизмах апоптотической гибели накоплен достаточный материал и зачастую они выполнены in vitro- в культурах клеток или же in vivo- в живых тканях или органах организма. Однако наиболее доступным и простым методом выявления морфологических особенностей апоптотических клеток является световая микроскопия. В данной работе в сравнительном аспекте приводятся динамика цитологической картины апоптоза в клетках печени человека и некоторых животных.

Ключевые слова: апоптоз, естественная гибель, морфология, цитология, печень.

Введение

Апоптоз представляет собой процесс программируемый клеточной гибели, играющий важную роль в поддержании тканевого гомеостаза. В печени также существует определенный жизненный цикл, по истечение которого клетки подвергаются естественной гибели. [1, 2] К настоящему времени накоплен значительный материал о механизмах апоптотической гибели, в большинстве случаев они выполнены на клеточных культурах- in vitro, либо в живых тканях, органах организма- in vivo, что не всегда отождествлят с истинными течением апоптоза в живой ткани. В связи с этим наиболее доступным и простым методом выявления апоптотических клеток с целью выяснения морфологических их особенностей является световая микроскопия гистологических препаратов. [2] Ранее нами было изучено светооптическими и электронномикроскопическими методами особенности морфологического течения апоптоза в клетках печени кроликов и белых крыс. В данной работе в сравнительном аспекте приводятся динамика цитологической картины апоптоза в клетках печени человека и некоторых других млекопитающих.

Материал и методы

Материалом служили печень половозрелых беспородных кроликов, белых крыс, домашних свиней и человека. Кролики и крысы содержались в обычных условиях вивария, домашние свиньи были отобраны из фермерских хозяйств одного потомства без признаков каких-либо патологией. Печень больных получали из морга Ташкентского Стоматологического медицинского института, умерших от различных заболеваний. Животные забивались с соблюдением этических норм, после вскрытия брюшной полости извлекали печень и обрабатывали общепринятыми гистологическими методами. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином или по ван Гизону и просматривались под иммерсией (х 100)микроскопа модели DN-300 M с цифровой камерой.

Результаты исследования

При окраске гематоксилин-эозином в печени крысы отчетливо выделяются гепатоциты, имеющие полигональную форму и оксифильную цитоплазму с одним или двумя базофильно окрашенными ядрами. Морфологический анализ паренхимы печени различных животных и человека показал , что у большинства крайне редко встречаются апоптотически клетки, а в единичных случаях чаще, примерно на 20 полей зрения приходится один апоптоз. Причем, начальные признаки апоптоза у всех животных и человека примерно идентичны и характеризуются появлением единичных вакуолей в цитоплазме гепатоцита (рис.1а). Затем количество вакуолей в цитоплазме гепатоцита нарастает от 4-5 до 8-10, и на этом этапе четко можно идентифицировать апоптоз (рис.1б), поскольку в окружающих клетках подобные вакуоли отстуствуют. Затем, крупные вакуоли в цитоплазме гепатоцита распадаются на более мелкие, точнее везикулы, клетка приобретает сферическую форму, а ядро клетки сморщивается( рис 1в). Следует упомянуть, что, как правило естественной гибели подвергаются единичные клетки, однако нами обнаружен апоптоз 3-х рядом расположенных гепатоцитов (рис.1г). На конечной стадии апоптоза, везикулярное состояние цитоплазмы сменяется нежносетчатым, клетка приобретает строго сферическую форму, цитоплазма выглядит светлым, а ядро еще больше пикнотизируется и клетка выбухает в сторону синусоида. Вероятно, после разрыва клеточной мембраны, содержимое клетки вымывается в просвет сосуда.

В отличие от печени крысы, в печени кроликов, по морфологическим признакам нами выявлены два типа апоптоза гепатоцитов. Первый тип соответствует вышеописанному апоптозу белых крыс. В цитоплазме клетки также появляются крупные вакуоли, которые постепенно заполняют цитоплазму, ядро пикнотизируется и клетка приобретает сферическую форму, в связи с чем резко отличаются от соседних. (рис.2а). В печени кроликов наблюдается и второй тип апоптоза, когда цитоплазма клеток гомогенизирована и окрашена оксифильно, а ядро фрагментирован на хроматиновые глыбки. При этом клетка также приобретает округлую форму, но не содержит вакуолей, однако также отчетливо выделяется граница клетки (рис.2б). О том, что в печени кроликов действительно встречается два типа апоптоза свидетельствует рисунок (рис.2в), где на небольшом участке паренхимы печени обнаруживается оба типа апоптоза. Цитологические признаки обоих типов отлчаются друг от друга. При первом типе апоптоза клетка имеет сферическую форму, цитоплазма сильно просветлена и представлена мелко везикулярными элементами, а ядро пикнотизировано (нижнняя часть рис). При втором типе апоптоза, цитоплазма гепатоцита окрашена оксифильно, не содержит ни вакуолей, ни везикул, а ядро фрагментировано на крупные глыбки (верхняя часть рис). На конечной стадии как первого , так и второго типа апоптоза, набухшие клетки выступают в сторону синусоида, а иногда элиминируются в просвет сосуда(рис.2г).

Печень свиньи при окраске по ван Гизону отчетливо выделяются дольки, границы которой представлены в виде прямых линий, представленных тонкими прослойками соединительной ткани. В области углов долек расположены печеночные триады. Печеночные пластинки и синусоидные капилляры ориентированы к центру дольки, где выявляется центральная вена. В печени свиньи, подобно печени кроликов и крыс, апоптоз встречается в единичных клетках и как правило, они обнаруживаются в перивенозных и изредка в промежуточных зонах дольки. Апоптотически измененные гепатоциты печени свиньи характеризуются неровными контурами и появлением 2-3 крупных вакуолей в их цитоплазме и незначительной конденсацией хроматина под ядерной оболочкой (рис.3а). Затем, количество вакуолей в цитоплазме возрастает до 5-8, в результате значительно увеличивается объем клетки, а под ядерной оболочкой усиливается концентрация хроматин ядра, возникает нитеподобные структуры. На следующем этапе, крупные вакуоли распадаются на более мелкие, поэтому, иногда наряду с 3-4 вакуолями средних размеров, в цитоплазме появлются многочисленные мелкие везикулярные элементы (рис.3б,в,г). В редких случаях в пределах дольки выявляются сразу несколько клеток находящиеся на разной стадии апоптоза. Во всяком случае в апоптотической клетке крупные вакуоли распадаются на мелкие везикулы, а сама клетка округляется и цитоплазма становится ярко светлой, и такую клетку легко обнаружить в паренхиме печени. Обычно, апоптозу подвергаются не только одноядерные, но и двуядерные гепатоциты. В подобных случаях также изменяется цитоплазма и ядра гепатоцитов, более того в данном случае, отчетливо прослеживается переход разнокалибрных вакуолей (рис.3в) в более мелкие везикулярные структуры (рис.3г), которые заполняют цитоплазму мелкими однообразными везикулами, вероятно соответствующими апоптотическим телам. В финальной стадии апоптоза в клетках печени свиньи апоптотические клетки наиболее отчетливо приобретают сферическую форму, объем клетки значительно увеличивается по сравнению с окружающими и везикулярные структуры придают им яркий светлый вид, в связи с чем нами обозначено как «бурлящая цитоплазма» (рис.3г). В завершении процесса апоптотическая клетка распадается на мелкие тела и вместе с пикнотизировнным ядром, вероятно, элиминируются в просвет синусоида. Появление макрофагов и захват соседними гепатоцитами апоптотические вакуоли в наших исследованиях не обнаружены.

Рисунок 1. Апоптоз в гепатоцитах. Объяснения в тексте.

Рисунок 2. Апоптоз в гепатоцитах. Объяснения в тексте.

Рисунок 3. Апоптоз в гепатоцитах. Объяснения в тексте.

Обсуждение полученных результатов

Во взрослом организме смерть клеток в печени сбалансировано с новообразованием клеток и в этом процессе важная роль отводится апоптозу. Как показали наши исследования, в печени митотическое деление встречается крайне редко (только у крыс обнаружено на 2000 клеток один митоз), очевидно это связано с особенностью органа, где наряду с делением клеток встречается полиплоидия и моногоядерность. Однако по сравнению с митозом чаще встречался апоптоз, более того у всех исследованных имеет схожое течение. Апоптозу, как обычно, подвергается единичные клетки, изредка групппа клеток, и в осоновном, в перивенозных, иногда в промежуточных зонах печеночной дольки. По цитологическиму течению и в зависимости от преимущественного изменения цитоплазмы или ядра нами выделены два его типа. Первый тип характеризуется просветлением цитоплазмы и пикнозом ядра, а второй тип, ацидофильной окраской цитоплазмы и глыбчатым распадом ядра, соответствено обозначенные как «бурлящая цитоплазма» и/или «ядерная катастрофа». Хотя оба типа апоптоза являются быстротечными процессами, однако в течении их можно разделить определенные этапы. При первом типе апоптоза: вакуолизация и увеличение объема клетки; везикуляция и округление; формирование апоптотических тел и пикноз ядра; отторожение и элиминация клеточного распада в просвет синусоида. Второй тип апоптоза характеризуется резкой ацидофилией цитоплазмы и глыбчатым распадом хроматина ядра, которые развиваются одновременно и выделять какие-то этапы не представляется возможным. Как показывают наши исследования все этапы первого типа апоптоза хорошо выявляются на гистологических препаратах, при окрсаке гематоксилин-эозином и по ван Гизону. Апоптоз первого типа начинается появлением 2-3 вакуолей, объем каждого больше чем ядро клетки, а затем количество их достигает 7-8 и клетка резко увеличивается в объеме. Появление вакуолей в цитоплазме гепатоцита в некоторых работах упоминается как везикуляция клеточной мембраны.

На следующем этапе вакуоли распадают на мелкие пузырьки и клетки округляются, приобретают сферическую форму, цитоплазма клетки выглядит как «бурлящая цитоплазма», а ядро подвергается пикнозу. Вследствие этих изменений цитоплазма просветляется, отчетливо выледеляется от других клеток и клетка выбухает в сторону просвета синусоида. Втророй тип апоптоза чаще встречался у кроликов и редко у крыс. Для второго типа апоптоза характерно ацидофильная окраска цитоплазмы гепатоцита и фрагментация ядра на глыбки хроматина. Очевидно, второй тип апоптоза представляет собой быстротечный процесс, поскольку редко выявляется в паренхиме печени, в связи этим невозможно разделить на отдельные этапы. Для второго типа апоптоза характерно распад клетки на зернистые структуры, фрагментация ядра на хроматиновые глыбки, а также вклинивание эритроцитов между в цитоплазму гепатоцита. Однако, округление клетки , отделение их от печеночной пластинки вымывание апоптотических тел в просвет синусоида идентичны с первым типом апоптоза. В некоторых исследованиях указывается, что апоптотические тела поглощаются соседними клетками или макрофагами. Биохимическими исследованиями показано, что процесс апоптоза состоит из 4-х отдельных стадий: начальная, эффекторная, стадия дерградации и поглощения. Очевидно, морфологическим иследованиям- вакуолизации, везикуляции сотответствует эффекторная стадия,а формированию апоптотических тел- стадия деградации, стадии эламинации –поглощению. Вероятно, эффекторная фаза связана с реограганизацией внутриклеточных актиновых филаментов, а именно периферийных кортикальных кольцевых пучков, в результате сокращений, клеточная мембрана образует вздутия, и в клетке появляются вакуоли. На следующем этапе деполимеризуются микротрубочки цитопскелета, вследствие чего клетка приобретает округлую форму, а клетка принимает пенистую структуру, клетка «кипит». В итоге клетка фрагментируется на маленькие апоптотические тела и элимирнируются в просвет сосуда.

Апоптоз играет большую роль в морфогенезе и является механизмом постоянного контроля размеров органов. Апоптоз хорошо выявляется как при гематоксилиновой окраске, так и при ван Гизону. И выявляется он как в виде светлых или резко ацифофильных клеток с плотным фрагментом ядерного материала. При анализе паренхимы печени человека и некоторых животных чаще встречался апоптоз, чем митотическое деление. После основополагающих работ Ker апоптозу отводится как фундаментальному физиологическому процессу, поддерживающий определенный баланс клеток в органе. Наблюдения показывают, апоптоз происходит по определенному морфологическому стероетипу. Апоптотические клетки встречались перимущественно в центральных и промежуточных зонах печеночной дольки. Однако в отличие от животных у человека апоптотические клетки выявлялись группами вокруг центральной вены. Изучение динамики цитологической картины апоптоза у человека и животных, позволяет выделить следующие этапы: вакуолизация, везикуляция-«кипение» цитоплазмы, сферизация, сморщивание ядра и экструзия -отторжение клетки с вымыванием содержимой клетки в просвет синусоида (при первом типе апоптоза). Ацидофильная окраска цитоплазмы с фрагментацией ядра и эламинация продуктов распада в просвет синусоида (при апоптозе второго типа), последнее преимущественно выявлены у кроликов и белых крыс. В связи с этим нами выделены два типа апоптоза «кипящая цитоплазма» и пикноз ядра (АПТ) и ацидофильная цитоплазма и распад ядра (АВТ). В печени человека и свиньи нами обнаруженны только первый тип апоптоза, сопровождающиеся вакуолизацией цитоплазмы и пикнозом ядра. На конечной стадии наступает пикноз ядра и клетка элиминирует в просвет синусоида. Последние стадии апоптоза , отделение клетки от печеночной пластинки, разрыв клеточной мембраны и вымывание содержимой цитоплазмы отчетливо выявлялись в печени кроликов и крыс. Апоптозные тела поглощаются соседними клетками или макфагами. Следовательно, в печеньи свиньи мы обнаружили только первый тип апоптоза, из которого следует, что для свиньи характерно только первый тип апоптоза. В литературе довольно редко встречается подробная картина морфологического течения апоптоза, ссылается на то, что апоптоз редкое явление, быстротечный процесс, морфологически трудно идентифицирумое и весьма трудоемкое. В других исследованиях указывается на возможные верификации апоптоза, при окраске гематоксилин-эозином. Действително процесс обнаружения апоптоза хотя утомительный и трудоемкий. Однако остается единственным способом идентификации апоптоза в тканях.

Список литературы

1. Галицкий, В. А. Возникновение эукариотических клеток и происхождение апоптоза / В. А. Галицкий // Цитология. — 2005. — Т. 47, № 2. — С. 103-120.
2. Титов С.А., Крутько В.Н. Современные представления о механизмах старения (Обзор) // Физиология человека. − 1996. − T. 22. − № 2. − С. 118- 123.
3. Altieri D.C. Survivin and IAP proteins in cell-death mechanisms // Biochem J. – 2010. – Vol. 430. – № 2. – Р. 199-205.
4. Cagnol S., Chambard J.C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death-apoptosis, autophagy and senescence // FEBS J. – 2010. – Vol. 277. – № 1. – P. 2-21.