УДК 575.85

Анализ поддержания ранних герминальных клеток в яичниках межвидовых гибридов Drosophila

Адашев Владимир Евгеньевич – инженер Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Оленина Людмила Владимировна – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Котов Алексей Александрович – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Аннотация: Межвидовая гибридная стерильность является широко распространённым феноменом, который позволяет предотвращать поток генов между близкородственными видами и поддерживать биологическое разнообразие. Но механизмы и процессы, приводящие к стерильности гибридов, в настоящее время малоизучены. В рамках данного проекта мы исследовали стерильность гибридных самок, потомков скрещивании мух Drosophila melanogaster и Drosophila simulans. Мы выявили, что оогенез в яичниках гибридов протекает с многочисленными нарушениями, и наиболее распространенным является отсутствие герминальных стволовых клеток в гермарии. Сравнительный анализ программируемой клеточной гибели позволил выявить, что в гермариях гибридных самок частота случаев клеточной гибели снижена по сравнению с родительскими видами. Полученные результаты позволяют предположить, что потеря герминальных стволовых клеток происходит через их вступление в дифференцировку с нарушением механизмов их самообновления.

Ключевые слова: гибридная стерильность, оогенез, герминальные стволовые клетки, программируемая клеточная гибель.

Введение

Необходимым условием для образования и поддержания биологического вида является его репродуктивная изоляция от других видов. Репродуктивная изоляция возникает вследствие случайного накопления различий между изолированными популяциями древнего предшественника, которые приводят к пониженной приспособленности или стерильности гибридного потомства [1]. В настоящее время молекулярно-клеточные механизмы, лежащие в основе феномена гибридной стерильности, в значительной степени неизвестны. Предположительно они включают в себя нелегитимную активность мобильных элементов, эпистатические взаимодействия между генами, дивергировавшими в родительских геномах, мейотический дрейф, межхромосомные перестройки, дозовый дисбаланс и др. Целью данной работы является сравнительный фенотипический анализ ранних стадий оогенеза в яичниках межвидовых гибридов, полученных при скрещивании самок D. melanogaster и самцов D. simulans. Изучение процессов и факторов, определяющих межвидовую гибридную несовместимость, позволяет улучшить понимание механизмов видообразования и поддержания биологического разнообразия.

Результаты и обсуждение

Для получения межвидовых гибридов мы провели скрещивания самок Drosophila melanogaster линии Hmr² [2] с самцами Drosophila simulans линии w501 при использовании стандартных лабораторных условий содержания мух при 20ºС. В гибридном потомстве F1 мы обнаружили около 25% самок, имеющих развитые до различной степени яичники. Для проведения последующих анализов мы отбирали яичники гибридных самок, имеющие как минимум пять развитых овариол, содержащих по несколько яйцевых камер в своем составе.

Каждый яичник самок Drosophila в норме состоит примерно из 16-20 овариол, представляющих собой последовательность развивающихся яйцевых камер [3]. На апикальном конце каждой овариолы расположен гермарий, структура, содержащая герминальные стволовые клетки яичников в окружении специализированных соматических клеток, формирующих нишу. На ранней стадии развития часть потомков стволовых клеток делится митотически с неполным цитокинезом, формируя 16-клеточные цисты. В каждой цисте внутри гермария одна из герминальных клеток дифференцируется в ооцит, а остальные пятнадцать клеток развиваются как полиплоидные питательные клетки. Затем цисты отпочковываются от гермария, образуя яйцевые камеры, окруженные множеством соматических фолликулярных клеток. Питательные клетки внутри цисты снабжают развивающийся ооцит питательными веществами, транскриптами и белками, необходимыми на протяжении всего оогенеза и раннего эмбрионального развития.

При помощи иммуноокрашивания и конфокальной микроскопии мы провели морфологический анализ яичников гибридных самок в сравнении с яичниками родительских видов. Для этого мы использовали антитела к маркёрам герминальных клеток (Vasa) и соматических клеток (Tj) яичников, а также интеркалирующий краситель хроматина DAPI. Мы нашли что, тогда как яичники самок родительских видов имеют нормальную морфологию, яичники гибридных самок имеют различные нарушения на многих стадиях оогенеза (рисунок 1). Наиболее частым нарушением является полное отсутствие герминальных стволовых клеток, что проявляется в гермариях, содержащих только соматические клетки. Только 15% проанализированных овариол в гибридных яичниках содержат герминальные клетки. К часто выявляемым дефектам также относятся: отсутствие ранних герминальных клеток на стадии митотических делений в гермарии; наличие яйцевых камер, содержащих менее 16 герминальных клеток; фрагментация хроматина в развивающихся ооцитах; нарушенный дорсальный аппендаж у зрелых ооцитов. Такие множественные нарушения указывают на то, что гибридная стерильность в данном случае вызывается комплексной дерегуляцией множества механизмов, поддерживающих продуктивный процесс оогенеза у родительских видов.

Рисунок 1. Иммунофлуоресцентный анализ яичников гибридов и родительского вида. Фиксированные препараты яичников были окрашены с помощью антител к Vasa (красный сигнал) и Tj (зелёный сигнал), хроматин окрашен с помощью DAPI (голубой сигнал). Изображения получены с помощью конфокального микроскопа. Изображение слева: только небольшая часть гермариев гибридных самок содержит герминальные клетки (белая стрелка). Изображение посередине: яйцевая камера в яичнике гибридной самки, содержащая менее 16 герминальных клеток (желтая стрелка). Изображение справа: яичники линии Hmr² D. melanogaster соответствуют дикому типу. Гермарий поддерживает ранние герминальные клетки (белая стрелка).

Фосфорилированный вариант гистона H2A в норме детектируется в хроматине ранних герминальных клеток как маркер двуцепочечных разрывов ДНК, возникающих в процессе митотических клеточных делений [4]. С помощью антител к фосфорилированному варианту гистона H2A (γ-H2AV) мы показали, что у гибридных самок этот сигнал детектируется в гермариях с более низкой частотой в сравнении с яичниками из родительских видов (рисунок 2). Эти данные указывают, что в яичниках гибридов митотические деления потомков герминальных стволовых клеток происходят с меньшей частотой, чем у родительских видов. Идентификация яйцевых камер в составе яичников гибридов, содержащих менее 16 герминальных клеток (рисунок 1), также подтверждает нарушения в числе митотических циклов при формировании таких цист в гермарии.

Рисунок 2. Анализ двуцепочечных разрывов в ранних герминальных клетках в гермариях яичников родительских видов и межвидовых гибридов. Фиксированные препараты яичников были окрашены с помощью антител к фосфорилированному варианту гистона H2A (γ-H2AV, зеленый сигнал) и к Tj (красный сигнал), хроматин окрашен с помощью DAPI (голубой сигнал). Изображения получены с помощью конфокального микроскопа. γ-H2AV-положительные сигналы (белые стрелки) детектируются в гермариях гибридных яичников, содержащих герминальные клетки, с более низкой частотой в сравнении с яичниками родительских видов, как показано на графике внизу справа.

Как мы показали выше, наиболее распространённым дефектом раннего оогенеза у гибридов является преждевременная потеря герминальных стволовых клеток. Такая потеря может быть вызвана гибелью стволовых клеток или их вступлением в процесс дифференцировки с нарушением процесса самообновления. Программируемая гибель герминальных клеток может происходить на различных стадиях оогенеза вследствие апоптотических, аутофагических или некротических процессов [5]. Гибель ранних клеток яичника может происходить в ответ на регуляторные сигналы, поступающие из ниши и/или окружающей среды.

Для оценки частоты событий программируемой гибели клеток во время оогенеза мы использовали метод TUNEL, детектирующий массивную фрагментацию хроматина во время события гибели клетки [5, 6, 7]. Согласно ранее опубликованным данным, гибель герминальных клеток гермария детектирована в 26% овариол у молодых самок D. melanogaster дикого типа [7]. Используя TUNEL анализ, мы показали, что у родительских видов события клеточной гибели детектировались в 44% гермариев для D. melanogaster (n= 75) и в 69% для D. simulans (n=42), соответственно. В случае яичников межвидовых гибридов мы обнаружили 31% TUNEL-позитивных гермариев, содержащих герминальные клетки (n=131) (рисунок 3). Это свидетельствует о том, что события программируемой клеточной гибели у гибридов происходят с более низкой частотой, чем в яичниках родительских мух. Полученные результаты указывают на то, что дефекты поддержания герминальных стволовых клеток в гермариях гибридных самок в основном не ассоциированы с процессами клеточной гибели.

Рисунок 3. TUNEL анализ в гермариях родительских видов и межвидовых гибридов (фиолетовый сигнал). Фиксированные препараты яичников также окрашены с помощью антител к Lamin (маркёр ядерной оболочки, красный сигнал), Tj (зелёный сигнал), хроматин окрашен с помощью DAPI (голубой сигнал). TUNEL-положительные герминальные клетки указаны белыми стрелками. Изображения получены с помощью конфокального микроскопа.

В данной работе мы провели анализ фенотипических особенностей яичников межвидовых гибридов между D. melanogaster и D. simulans. Согласно полученным данным, оогенез у гибридных самок проходит с множественными нарушениями, при этом преждевременная потеря герминальных стволовых клеток в гермарии является наиболее частым из них. Мы показали, что частота случаев программируемой клеточной гибели в гермариях гибридов снижена в сравнении с родительскими видами. Это позволяет предположить, что потеря герминальных стволовых клеток происходит вследствие их вступления в дифференцировку с нарушением механизма их самообновления в нише. Дальнейшие исследования помогут выяснить, происходит ли такая потеря автономно, благодаря внутриклеточным процессам, или неавтономно, благодаря нарушениям в межклеточных молекулярных сигналах, исходящих из соматических клеток ниши.

Список литературы

1. Orr H.A., Presgraves D.C. Speciation by postzygotic isolation: forces, genes and molecules // Bioessays. 2000. № P. 1085-1094.
2. Barbash D.A., Ashburner M. A novel system of fertility rescue in Drosophila hybrids reveals a link between hybrid lethality and female sterility // Genetics. 2003. № P. 217-226.
3. Xie T., Spradling A.C. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary // Science. 2000. № P. 328-330.
4. Lake C.M., Holsclaw J.K., Bellendir S.P., Sekelsky J., Hawley R.S. The development of a monoclonal antibody recognizing the Drosophila melanogaster phosphorylated histone H2A variant (γ-H2AV) // G3. 2013. № P. 1539-1543.
5. Pritchett T.L., Tanner E.A., McCall K. Cracking open cell death in the Drosophila ovary // Apoptosis. 2009. № P. 969-979.
6. Kibanov M.V., Kotov A.A., Olenina L.V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis // Anal. Biochem. 2013. № P. 55-64.
7. Nezis I.P., Lamark T., Velentzas A.D., Rusten T.E. Bjørkøy G., Johansen T., Papassideri I.S., Stravopodis D.J., Margaritis L.H., Stenmark H., Brech A. Cell death during Drosophila melanogaster early oogenesis is mediated through autophagy // Autophagy. 2009. № P. 298-302.
8. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-74-00029, https://rscf.ru/project/22-74-00029/.