Влияние умеренной гипотермии и церебрамина на показатели свободнорадикальных процессов в мозге крыс в модели окклюзии сонных артерий

Гусейнов Герман Омарович – доцент кафедры Общей и биологической химии Дагестанского государственного медицинского университета Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Аннотация: Проведены исследования по влиянию различных эффектов умеренной гипотермии и церебрамина на критерии свободнорадикальных процессов в мозге крыс в модели окклюзии сонных артерий. В рамках окклюзии сонных артерий (ОСА) недостаточная активация различных ферментов, восстанавливающих формирующиеся гидроперекиси липидов, помогает накоплению ТБК-реактивных продуктов в мозге крыс. Во время гипотермии накопление различных ТБК-реактивных продуктов в коре больших полушарий оказалось выше, чем аналогичный процесс в стволовых структурах. При этом в модели ввода церебрамина перед ОСА, а также во время моделирования ОСА перед гипотермией уровень интенсивности окислительного стресса оказался ниже относительно животных, которым решили моделировать ОСА. Во время ввода церебрамина перед ОСА и дальнейшей гипотермии уровень интенсивности свободнорадикальных процессов оказался приближен к контролю. Сделали предположение о том, что сочетанное воздействие церебрамина и гипотермии способно оказать более значительное протекторное влияние на различные метаболические процессы в мозге крыс во время окклюзии сонных артерий относительно их раздельного использования. Выявлены региональные различия в области состояния антиоксидантного статуса (в коре больших полушарий и в стволовых структурах) в различных экспериментальных моделях.

Ключевые слова: Церебрамин, умеренная гипотермия, окклюзия сонных артерий, свободнорадикальные процессы.

Патофизиологической базой для развития реперфузионного и ишемического повреждений мозга крыс выступает нарушение в области кровоснабжения мозга [1]. При этом ишемия мозга крыс способна провоцировать энергетическое голодание в области ткани мозга, повреждение клеточных мембран мозга из-за высокой реактивности свободных радикалов, находящихся в мозге. В ходе таких изменений в нейронах и глиальных клетках коры мозга возникают нарушения процессов рецепторного связывания [3–4]. Ещё реперфузионные и ишемические изменения мозга крыс приводят к аккумуляции различных повреждений структуры ДНК в ходе окислительного стресса, что в последующем ведёт к запуску определённого процесса омертвления клетки [2]. Совокупность реакций, которые сопровождают различные ишемические/реперфузионные повреждения коры мозга, встречаются вместе с гипотермией, что способно усугубить уровень повреждений нейронов головного мозга [4].

Объектом изучения выступили 128 белых беспородных половозрелых крыс-самцов возрастом шести месяцев, обладающих массой 200–250 г. Крыс содержали в условиях вивария при соблюдении температуры на уровне +18–20°С на обычном рационе пропитания. Для того, чтобы избежать сезонных колебаний в области метаболизма и регуляции функций, опыты осуществляли в зимний период: декабрь – февраль.

Животных поделили на следующие категории: 1-я выборка – ложнооперированные крысы (л/о, контрольная выборка, n = 16). 2-я выборка – крысы, которым осуществляли перевязку правой сонной артерии (ПСА) на 3 минуты (с дальнейшей суточной реоксигенацией) и левой сонной артерии (ЛСА) на сутки (n = 16). 3-я выборка – крысы, которым перорально (per os) ввели церебрамин на протяжении 5 суток (кормление 1 раз в 24 часа в утренние часы) дозой 0,5 мг/кг с дальнейшим осуществлением ложной операции (n = 16). 4-я выборка – крысы которым до проведения 3-минутной окклюзии ПСА и суточной окклюзии ЛСА перорально ввели церебрамин дозой 0,5 мг/кг на протяжении 5 суток (n = 16). 5-я выборка – крысы, которых после осуществления ложной операции переводили в холодовую камеру с охлаждаемой водяной рубашкой, конструкция которой помогала регулировать степень охлаждения и постоянно отмечать термодатчиком ректальную температуру тела крысы с точностью до 0,010°С (n = 16). 6-я выборка – крысы, которых после осуществления 3-минутной окклюзии ПСА и суточной окклюзии ЛСА перемещали в холодовую камеру (n = 16). 7-я группа – крысы, которым перорально добавляли церебрамин на протяжении 5 дней. После осуществления ложной операции животных перемещали в холодовую камеру (n = 16). 8-я выборка – крысы, которым до осуществления 3-минутной окклюзии ПСА и суточной окклюзии ЛСА перорально добавляли церебрамин дозой 0,5 мг/кг на протяжении 5 дней. После осуществления операции крыс перемещали в холодовую камеру (n = 16).

Через сутки после проведения операции крыс декапитировали, мозг извлекли на холоде и выделили кору и стволовые структуры. Ишемизацию головного мозга моделировали с помощью перевязки левой сонной артерии на 24 часа и через минуту правой сонной артерии на 3 минуты с дальнейшей суточной реоксигенацией [2]. Гипотермию моделировали с помощью размещения крыс 5–7 выборок в холодовые камеры до той поры, пока ректальная температура животных не снижалась до 30°С (характерно для умеренной гипотермии). При этом температура воды в водяной рубашке составляла 8°С.

Содержание различных ТБК-реактивных продуктов выясняли флюориметрическим методом, рассмотренным А.В. Арутюнян и т.д. [1]. Активность глутатионпероксидазы выясняли по быстроте окисления восстановленного глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила по методике [8]. Выяснение концентрации ВГ осуществляли с помощью метода G.L. Ellman [6]. При этом активность глутатионредуктазы выявляли по быстроте окисления НАДФН2 методикой [3]. Выяснение активности глутатион-S-трансферазы осуществляли по методике, рассмотренной в пособии [6]. При этом активность каталазы выясняли с помощью методики М.А. Королюка.

В табл. 1–2 приведены данные по исследованию состояния про- и антиоксидантного статуса в головном мозге экспериментальных крыс. В модели окклюзии сонных артерий (2 выборка) обнаружено накопление гидроперекисей липидов и различных ТБК-реактивных продуктов в мозге животных на фоне увеличения активности ГПО и ГТ, а также уменьшения содержания ВГ по сравнению с контролем. Помимо этого, продемонстрировано уменьшение активности ГР в коре больших полушарий по сравнению с контрольной выборкой. Соответственно, в рамках окклюзии сонных артерий малая активация ферментов, призванных восстановить формирующиеся гидроперекиси липидов, помогает накоплению различных вторичных продуктов свободнорадикальных процессов (СРП) в структурах мозга крыс. Возможно, это выявлено в связи с сокращением синтеза ВГ и активности ГР в клетках в рамках развивающегося ацидоза в случае ишемии мозга.

Таблица 1. Воздействие церебрамина и гипотермии на содержание гидроперекисей липидов, ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП), восстановленного глутатиона (ВГ), активность каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионтрансферазы (ГТ), глутатионредуктазы (ГР) в коре больших полушарий подопытных крыс, (M ± m).

Примечание. * достоверные (р <0,05) отличия показателей по сравнению с контрольными значениями.

Таблица 2. Воздействие церебрамина и гипотермии на содержание гидроперекисей липидов, ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП), восстановленного глутатиона (ВГ), активность каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионтрансферазы (ГТ), глутатионредуктазы (ГР) в стволовых структурах мозга подопытных крыс, (M ± m).

Примечание. * достоверные (р <0,05) отличия показателей по сравнению с контрольными значениями.

Во время моделирования гипотермии (5 выборка) тоже отмечали увеличение содержания липоперекисей и ТБК- реактивных продуктов в структурах мозга крыс. При этом антиоксидантный статус в коре больших полушарий и стволовых структурах не был одинаков. В том числе в коре больших полушарий выявлено уменьшение уровня ВГ и активности ГР, тогда как в стволовых структурах на фоне уменьшения активности ГР и каталазы обнаружен рост активности ГТ и содержания ВГ по сравнению с контрольной выборкой. В итоге накопление вторичных продуктов СРП в коре больших полушарий оказалось выше, чем в стволовых структурах.

У крыс в модели окклюзии сонных артерий и дальнейшей гипотермии (6 категория) увеличение содержания липоперекисей в структурах мозга оказалось в меньшей степени выраженным по сравнению с животными, которым моделировали ОСА или гипотермию: в 6 категории животных существенное накопление различных первичных продуктов СРП выявили лишь в коре больших полушарий относительно контрольной выборки. Вместе с тем наблюдали увеличение активности ГПО и ГТ на фоне сокращения содержания ВГ в головном мозге. При этом подобные изменения осуществлялись при разноплановых изменениях активности ГР в структурах мозга: если в коре больших полушарий осуществлялось сокращение этого показателя, то в стволовых структурах – его увеличение относительно контрольной выборки. Ещё в стволовых структурах продемонстрировано увеличение каталазной активности в сравнении с 1-й выборкой животных. Итак, в этой модели проведения эксперимента определены особенности ответа антиоксидантного звена свободнорадикальных процессов в различных структурах мозга крыс : предотвращение излишней активации СРП в коре больших полушарий осуществляется на фоне роста антиоксидантной ёмкости ГПО и ГТ, тогда как в стволовых структурах – главным образом с помощью активации ГТ и каталазы. Известно, что сродство ГПО к пероксиду водорода выше, чем у каталазы, в связи с этим первая более успешно функционирует при невысоких концентрациях субстрата, в то же время при значительных концентрациях важнейшее значение отводится каталазе [7]. На самом деле, согласно полученным итогам исследования, как раз в коре больших полушарий осуществляется накопление гидроперекисей.

Во время ввода церебрамина (3 категория) рост содержания ТБК-реактивных продуктов осуществлялся лишь в коре больших полушарий животных относительно контрольной группы. Вместе с тем, продемонстрирован рост в структурах мозга ещё и уровня ВГ, активности ГТ и каталазы; в коре больших полушарий ещё выявлено увеличение активности ГПО. Рост про- и антиоксидантных звеньев свободнорадикальных процессов во время ввода пептидных препаратов связывают с особым их прекондиционирующим эффектом [5].

В рамках ввода церебрамина до моделирования ОСА (4 категория) в мозге обнаружено накопление липоперекисей и ТБК-реактивных продуктов, активности ГПО и ГТ относительно контрольной выборки. Ещё в коре больших полушарий оказалась уменьшена активность ГР и увеличена каталазная активность, при этом в стволовых структурах активность ГР оказалась выше контрольных значений. Соответственно, ввод церебрамина перед ОСА уменьшает интенсивность СРП в мозге крыс, при этом механизмы, находящиеся в основе такого явления, различны в коре больших полушарий и стволовых структурах: в коре больших полушарий значительную роль в уменьшении накопления продуктов СРП берут на себя различные ферменты, отличающиеся каталазной активностью, тогда как в стволовых структурах – глутатионтрансфераза.

Во время ввода церебрамина перед гипотермией (7 выборка) изменения различных показателей СРП определены лишь в стволовых структурах: осуществлялось увеличение уровня липоперекисей и активности глутатионтрансферазы по сравнению с контролем. В модели ввода ноотропа перед ОСА и моделированием гипотермии (8 выборка) тоже обнаружены небольшие отклонения от контрольных значений в состоянии СРП. Например, в коре больших полушарий продемонстрировано накопление липоперекисей на фоне уменьшения активности ГР, а также активности ГПО (0,1 < р < 0,05); в стволовых структурах отмечали только увеличение активности ГТ.

Итак, сочетанное воздействия церебрамина и гипотермии способно оказать более значительное протекторное действие на различные метаболические процессы в структурах мозга животных во время окклюзии сонных артерий, чем их раздельное использование в виде факторов, уменьшающих эффекты ишемии мозга крыс. Кроме того, определены региональные различия особых защитных механизмов против дальнейшего развития окислительного повреждения мозговой ткани.

Список литературы

1. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. – М., 2001. – 328 с.
2. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньщикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков и др. – М.: Слово, 2006. – 556 с.
3. Эмирбеков Э.З., Пашаева М.Э., Эмирбекова А.А. Молекулярные процессы в мозге при принудительной гипотермии. – Ростов-на-Дону: Изд-во Южного федерального университета, 2012. – 122 с.
4. Эмирбеков Э.З., Айдунбеков Ф.Т. Влияние гипотермии и церебрамина на содержание моноаминов в мозге и крови крыс при окклюзии сонных артерий // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. – 2009. – № 4. – С. 78–81.
5. Эмирбеков Э.З., Айдунбеков Ф.Т. Влияние сочетанного воздействия гипотермии, церебрамина и окклюзии сонных артерий на баланс аминокислотных нейротрансмиттеров в мозге крыс // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. – 2009. – № 1. – С. 70–73.
6. Ji X., Luo Y., Ling F. et al. Mild hypothermia diminishes oxidative DNA damage and pro-death signaling events after cerebral ischemia: a mechanism for neuroprotection. // Front Biosci. – 2007. – Vol. 12. – Р. 1737–1747.
7. Luo Y., Ling F., Li W. et al. Impaired DNA Repair Via the Base-excision Repair Pathway After Focal Ischemic Brain Injury: a Protein Phosphorylation-dependent Mechanism Reversed by hypothermic Neuroprotection // Front Biosci. – 2007. – Vol. 12. – P. 1852–1862.
8. Noor R., Wang C.X., Shuaib A. Hyperthermia Masks the Neuroprotective Effects of Tissue Plasminogen Activator // Stroke. – 2005. – Vol. 36. – P. 665–669.
9. Van Hemelrijck A., Hachimi-Idrissi S., Sarre S. et al. Post-ischemic Mild Hypothermia Inhibits Apoptosis in the Penumbral Region by reducing neuronal Nitric Oxide Synthase Activity and Thereby Preventing Endothelin-1-induced Hydroxyl Radical Formation // Eur. J. Neurosci. – 2005. – Vol. 22. – № 6. – P. 1327–1337.