gototopgototop

УДК 57.065

Систематическое положение группы microsporidia

Преображенская Юлия Андреевна – студент Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Аннотация: Данный обзор посвящен анализу группы Microsporodia, направленному на установление систематического положения данной группы, выяснение филогенетических связей и построение филогенетических деревьев на основе белковых последовательностей, выявление закономерностей эволюции белков, сравнение структур кристаллов белков, поиск консенсусных последовательностей в полученных выравниваниях. Решение данных задач поможет в разработке лекарств от микроспоридиальных инфекций человека и животных (что наносит ежегодно мощный ущерб хозяйству).

Ключевые слова: Microsporidia, эволюция, филогенетика.

Введение. В конце XX века в специализированной литературе можно было найти данную группу в составе паразитических протист неясного систематического положения (так как до появления молекулярных методов анализа существовал таксон Fungi, как правило, относимый к Plantae, так же как и Bacteria и Archaea, лишь позже появился отдельный класс Protista). Долгое время предполагалось, что Microsporea являются наиболее примитивными эукариотами, поскольку для них характерны такие примитивные (плезиоморфные) признаки, как 70S рибосомы (с 16S и 23 S рРНК), и некоторые другие прокариотные черты. Жгутики, центриоли и настоящие, содержащие более трех цистерн, диктиосомы также отсутствуют [1].

Гипотеза Archezoa (утверждающая, что данный таксон более древний, чем грибы и простисты) была основана на отсутствии митохондрий в исследованиях методами микроскопии. Однако позднее были обнаружены следы митохондрий – пируват-дегидрогеназный комплекс и HSP70; тельца, которые удалось получить, индуцируя экспрессию соответствующих ядерных генов, называют митосомами, некоторые маркерные белки были обнаружены в цитозоле [2]. Также отсутствие копий генов, кодирующих рибосомальные типы РНК, что свойственно для прокариот, но не для эукариот, сбивало с толку. Затем в связи с развитием токсикологии и паразитологии интерес к Microsporidia возрос и чаще стали обращаться к их протеому и геному, однако проблема их классификации стала более очевидной. В начале 2000-х полноценный обзор показал довольно близкое родство с грибами, была обнаружена консенсусная последовательность, присутствующая только у грибов, животных и архей, был проведен анализ более 20 последовательностей аминокислот.

Это очень мелкие одноклеточные организмы без жгутиков. Диаметр спор варьируется от 1 до немногим более 20 мкм. Все без исключения микроспоридии — внутриклеточные паразиты. Обычно их трофонты свободно лежат в цитоплазме клетки хозяина, но иногда — внутри паразитофорной вакуоли. Всего известно 1200 видов в составе 144 родов. В состав хозяев микроспоридий входят как одноклеточные организмы (Apicomplexa, Ciliophora), так и многоклеточные (миксоспоридии, книдарии, плоские черви, нематоды, мшанки, кольчатые черви, моллюски, членистоногие и позвоночные). В наибольшей мере микроспоридии освоили членистоногих и костных рыб. Среди млекопитающих они поражают преимущественно грызунов, хищников и некоторых приматов.

Микроспоридии имеют самый маленький из всех известных ядерный ге-ном, однако плотность генов очень высока [1].

Все представители данной группы попадают в клетку сходным образом – используют характерные структуры – поляропласт, спиральную нить, заднюю вакуоль.

Таким образом, данный анализ проводился с целью попытаться установить систематическое положение Microsporidia, а также поиск гомологов белков-маркеров вышеуказанных структур, что может ускорить процесс создания лекарств против микроспоридиозов.

Актуальность. Исследуя систематическое положение Microsporidia, мы анализируем белковые последовательности с помощью наиболее современных программ; установление родства с группами, являющимися паразитами человека и животных может ускорить процесс создания лекарств против микроспоридиозов.

Целью данного исследования является установление систематического положения Microsporidia.

Основные задачи исследования: провести выравнивания выбранных белков среди Viridiplantae, Fungi, Microsporidia, Archaea, Parabasalia, Diplomonadida, Metazoa; построить филогенетические деревья на основе полученных выравниваний; проанализировать последовательности на наличие консервативных участков; проверить родство на основе трехмерной структуры белков.

Материалы и методы. Белковые последовательности были получены из базы данных UniProt [3], нуклеотидные последовательности из базы данных EBBL [4]. Мы подбирали последовательности схожей длины, пользуясь алгоритмом поиска гомологов BLAST, а также отбирали вручную. При создании выравниваний использовались средства JalView (алгоритм Muscle для белков и Mafft для нуклеотидных последовательностей) и MEGA6, которая также применялась для построения деревьев методом Neighbor-joining. Для визуализации структур применялись программы PyMol и Jmol.

Анализировались следующие белки:

  1. Гистоны H2A
  2. ДНК-полимераза
  3. ДНК-зависимая РНК-полимераза
  4. ГТФаза
  5. Глицинил-тРНК-синтетаза
  6. EF-1-alpha
  7. TF IIB
Данная выборка не случайна: здесь отображены наиболее консервативные белки. Далее приведем анализ каждого филогенетического древа по всем белкам выбранных представителей.

Научная новизна. Впервые был проведен комплексный анализ указанных последовательностей у перечисленных групп, а также построены филогенетические деревья, оценена скорость эволюции данных групп на основе комплексного анализа.

Результаты исследования.

1. УСТАНОВЛЕНИЕ РОДСТВА МЕТОДОМ ПОСТРОЕНИЯ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕРЕВЬЕВ.

Гистон H2A:

(1) Microsporidia – базальная ветвь по отношению к грибам, Metazoa, паразитическим протистам.

(2) Наиболее близко располагаются к к микроспоридиям Myxomycota.

(3) Внутри Metazoa наблюдаются разные тенденции.

 

Рисунок 1. Реконструкция филогенетического древа по гистону Н2А. Fungi: Puccinia striiformis f. sp. Tritici, Piriformospora indica, Serpula lacrymans var. lacrymans; Metazoa: Xenopus laevis, Homo sapiens, Caenorhabditis japonica; Placozoa: Trichoplax adhaerens; Excavata; Histomonas meleagridis; Alveolata: Paramecium tetraurelia; Myxomycota: Dictyostelium discoideum; Archaea: Methanocaldococcus jannaschii; Microsporidia: Encephalitozoon cuniculi

ДНК-полимераза E:

(1) Как можно видеть из древа, ветвь микроспоридий базальна по отношению к Fungi и Archaeplastida, но все же с Fungi последовательность более схожа, чем с ветвью Archaeplastida.

(2) Полимеразы “высших” и “низших” растений отличаются в большей степени друг от друга, чем те же белки аскомицетов и базидиомицетов.

(3) Также можно заметить, что ДНК-полимеразы типа архей и микроспоридий наиболее схожи.

 

Рисунок 2. Реконструкция филогенетического древа по ДНК-полимеразе. Fungi: Ustilago hordei, Mucor ambiguus, Rhizopus microsporus; Metazoa: Homo sapiens, Schistosoma mansoni; Viridiplantae: Arabidopsis thaliana, Volvox carteri f. nagariensis, Chlamydomonas reinhardtii; Archaea: Haloquadratum walsbyi; Microsporidia: Nematocida sp.

Глицинил-тРНК-синтетаза (далее – ГТРС):

(1) ГТРС грибов и растений имеют общего предка.

(2) Parabasalia и Archaea сестринские группы, отстоящие от Microspotidia.

(3) Микроспоридии – базальная ветвь по отношению к грибам и растениям.

 

Рисунок 3. Реконструкция филогенетического древа по глицинил-тРНК-синтетазе. Fungi: Schizosaccharomyces pombe, Talaromyces marneffei; Parabasalia: Giardia intestinalis, Trepomonas sp.; Viridiplantae: Solanum lycopersicum, Liriodendron tulipifera; Archaea: Methanopyrus kandleri; Microsporidia: Encephalitozoon cuniculi.

ДНК-зависимая РНК-полимераза:

(1) Микроспоридии – базальная ветвь по отношению к Fungi, Diplomonadida, Metazoa.

(2) Микроспоридии и Viridiplantae не имеют общего предка и принадлежат разным эволюционным линиям.

(3) Diplomonadida – базальная ветвь по отношению к Metazoa и Fungi.

(4) Микроспоридии наиболее близки к Diplomonadida.

 

Рисунок 4. Реконструкция филогенетического древа по ДНК-зависимой РНК-полимеразе. Fungi: Schizosaccharomyces pombe, Talaromyces marneffei; Parabasalia: Giardia intestinalis, Trepomonas sp.; Viridiplantae: Solanum lycopersicum, Liriodendron tulipifera; Archaea: Methanopyrus kandleri; Microsporidia: Encephalitozoon cuniculi.

ГТФазы:

(1) Микроспоридии – базальная ветвь по отношению к Fungi,Viridiplantae, Metazoa.

(2) Diplomonadida – базальная ветвь по отношению к микроспоридиям.

(3) Микроспоридии наиболее близки к грибам и метазоем – базальная ветвь по отношению к Metazoa и Fungi.

(4) Микроспоридии наиболее близки к Diplomonadida.

 

Рисунок 5. Реконструкция филогенетического древа по ГТФазе. Fungi: Puccinia graminis f. sp. Tritici; Parabasalia: Giardia intestinalis; Viridiplantae: Solanum lycopersicum, Liriodendron tulipifera; Archaea: Lokiarchaeum sp.; Microsporidia: Pseudoloma neurophili; Diplomonadida: Trichomonas vaginalis; Metazoa: Danio rerio, Homo sapiens; Heterolobosea: Naegleria gruberi, Entamoeba histolytica

TF-II:

(1) Микроспоридии относятся к одному ответвлению с Fungi.

(2) Parabasalia базальны по отношению к другим рассматриваемым таксонам.

(3) Ветвь, включающая грибы и микроспоридии, отстоит далеко от ветви, включающей растения и метазои .

(4) Parabasalia не являются сестринским таксоном, парафилетической группой, полифилетической группой, базальной группой по отношению с грибам и микроспоридиям.

 

Рисунок 6. Реконструкция филогенетического древа по TF-II. Fungi: Mucor ambiguous, Rhizopus microsporus; Parabasalia: Giardia intestinalis; Viridiplantae: Glycine max, Arabidopsis thaliana; Archaea: Pyrococcus woesei, Haloferax volcanii; Microsporidia: Encephalitozoon cuniculi; Metazoa: Danio rerio, Homo sapiens.

2. УСТАНОВЛЕНИЕ РОДСТВА С УЧЕТОМ КОНСЕНСУСНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ.

Было высказано предположение, что некая последовательность из 10 нуклеотидов является характерной для грибов, метазоев и микроспоридий.

Сначала зафиксируем наличие или отсутствие последовательности среди организмов выбранных групп.

EF-1-alpha:

(1) Между положениями 210 и 219 у грибов, метазоев и микроспоридий зажата консенсусная последовательность, отсутствующая у растений и архей.

(2) Наиболее консервативные позиции – 211, 212, 219.

(3) Parabasalia имеет глицин в 219 позиции

 

Рисунок 7 Фрагмент выравнивания ef-1-alpha, где выделена предполагаемая консервативная последовательность. Подборка организмов с помощью BLAST.

Затем проверим, встречается ли данная последовательность в других таксонах:

(1) Между положениями 216 и 229 у грибов, метазоев и микроспоридий зажата консенсусная последовательность.

(2) У Myxomycota, Parabasalia, Diplomonadida, Archaea, Bacteria, Viridiplantae отсутствует эта последовательность.

(3) Наблюдается вариабельность в последних трех остатках.

 

Рисунок 8. Фрагмент расширенного выравнивания ef-1-alpha, где выделена предполагаемая консервативная последовательность. Подборка организмов с помощью BLAST.

3. УСТАНОВЛЕНИЕ РОДСТВА С УЧЕТОМ СТРУКТУРЫ КРИСТАЛЛА.

 

Рисунок 9. Структура кристалла ef-1-alpha человека (2), где выделена предполагаемая консервативная последовательность (1). Окраска по вторичной структуре. PDB 1SYW. Показано в Jmol, PyMol.

 

Рисунок 10. Структура кристалла ef-1-alpha Sulfolobus solfataricus (2), где выделен регион с отсутствующей консервативной последовательностью (1). Окраска по вторичной структуре. PDB 1JNY. Показано в Jmol, PyMol.

Различия в структурах:

(1) У растений вторичная структура представлена более чем одним доменом.

(2) У архей и растений характерные остатки (K, Y), предшествующие последовательности, заменены на иные

(3) У архей и грибов 2 цепи, у метазоев и растений – 1.

(4) У грибов структура представлена более чем 1 доменом.

 

Рисунок 11. Структура кристалла ef-1-alpha Saccharomyces cerevisiae (1) и модель структуры ef-1-alpha Zea mays (2). Окраска по вторичной структуре. PDB 1F60, Protein Model Portal, Q41803. Показано в PyMol.

Обсуждение. Безусловно, большинство приведенных результатов (за исключением РНК-полимеразы) свидетельствуют о родстве с Fungi. Однако обсудим сначала несогласующиеся результаты.

Данные по гистонам показывают близкое родство с Myxomycota, относимыми ранее к грибоподобным организмам.

С одной стороны, можно найти на первый взгляд противоречивые данные о вхождении в единый парафилетический таксон с археями (ДНК-полимераза, данные о структурах ef-1-alpha).

Также сбивает с толку вхождение в парафилетический таксон с Diplomonadida по ГТФазе и РНК-полимеразе.

Проливают свет на эти моменты данные по выравниванию белков TF-II (и соответствующее древо) и поиску организмов, EF-1-alpha которых содержит консенсус. В первом случае очевидно вхождение в один монофилетический таксон с Fungi (родство с Ascomycota и Zygomycota), с учетом высокой консервативности этого белка. Возможное родство со слизевиками опровергает отсутствие у них в EF-1-alpha консенсусной последовательности, характерной лишь для грибов и метазоев. Наличие 2 цепей EF-1-alpha у грибов (значительно меньше) и архей и наличие лишь 1 у метазоев может свидетельствовать о существовании архаичных черт, присущих грибам или являться результатом случайного сходства, установление чего не входило в рамки исследования.

Заключение. Таким образом можно объяснить сходство некоторых белковых последовательностей микроспоридий, грибов, парабазалий и дипломонад. Кроме того, быстрая эволюция паразитических протист и микроспоридий внесла определенный вклад в картину понимания эволюции этих групп.

Список литературы

1. Hausman K., Hjul'sman H., Radek R. Protistologija: Rukovodstvo Pod red. S.A. Korsuna. Per. s angl. S.A. Karpova. — M.: Tovarishhestvo nauchnyh izdanij KMK, 2010. — 495 s

2. Lynne S. Garcia Laboratory Identification of the Microsporidia// Journal of Clinical Microbiology– June 2002 - vol. 40 no. 6 - 1892-1901

3. UniProt Database [Электронный ресурс] URL: http://www.uniprot.org/ (дата обращения 21.06.2016).

4. The European Bioinformatics Institute [Электронный ресурс] URL: http://www.ebi.ac.uk/ (дата обращения 19.06.2016).

Печать